2023-12-11 15:03:01, 生物医药市场部 1有限公司
全文2577字,开启5分钟技术探索之旅
供稿丨Paul
摘要
疫情以来,mRNA疫苗迅速破圈走红,刮起了一场“催生新一代疗法的医学革命”。[1]实际上,早在1960年代,科研人员就首次发现了mRNA。此后历经半个多世纪的探索,直至2020年新冠mRNA疫苗上市,这款被寄予厚望的明星产品终于走向商业化落地的初舞台。[2]
mRNA技术大放异彩的背后,是工艺技术的大跨步进展。研究表明,核酸的Poly A结构可以让mRNA在细胞中免受核酶的降解,增强mRNA的稳定性,同时Poly A结构长度可以控制转录效率。因此,有效地检测核酸尾部Poly A的长度及不同长度A的占比是评估mRNA质量的重要指标。
随着越来越多mRNA产品的研发申报,客户对于polyA分析方法的可靠性和完成周期提出了更高的要求,这也对研究型实验室提出了更高的挑战。本期#微谱药研院·技术共探,我们将共同探讨LC-MS法检测mRNA核酸Poly A尾长的原理,以两则案例展开分析,并就常见问题给予答疑。如果还有更多疑问,欢迎文末留言讨论!
一、方法原理
mRNA样本的Poly A酶切处理一般采用Rnase T1酶。T1酶的特异性酶切位点是G碱基右侧的磷酸二酯键,而酶切后的Poly A尾片段回收方式一般有两种:一是直接将Poly A尾片段从mRNA中进行直接分离后上机分析;二是在前一步基础上,再利用Oligo磁珠提取Poly A尾巴片段进行上机分析(LC-MS)。
二、案例分析
CASE 01
T1酶直接酶切,前处理简单,但是杂质较多。对于碱基个数多的核酸片段,出峰时间会靠后,见图1。对单个峰进行原始质荷比图的提取,通过原始质荷比图的特征定位Poly A尾巴片段。
▲图1:直接酶切后的TIC图
Poly A尾巴片段的原始质荷比图为正态分布或者类正态分布,见图2。
▲图2:原始质荷比图
再对质谱数据进行解卷积分析可得到结果,见图3。
▲图3:解卷积图谱
CASE 02
与前面的方法相比,加入olig磁珠虽然使得前处理变复杂,成本也会相对升高,但最终呈现的效果会有明显提升,杂峰也显著减少,见图4。
▲图4:酶切加磁珠纯化后的TIC图
对于一个mRNA样品, 假设理论序列如图5所示。采用T1酶酶切,可能会有2段Poly A尾巴片段。但是多段尾巴可能在TIC图上是重叠的,原始质荷比图也会有所重叠,但分子量不会重叠,如图4所示,RT为8.81min的峰,其实是两段Poly A尾巴片段(碱基差异值是35A)的重叠。
▲图5:某个核酸的理论序列与酶切位点
1) 当碱基个数相差更多时,可在TIC图上看到区别,同样原始质荷比图可以看到有所叠加,如图6所示。根据碱基个数多的核酸片段,出峰时间会靠后的特点,合理选择提取原始质荷比图的范围或者优化液相参数,可对被T1酶切成两段的Poly A尾巴片段进行数据分析。
▲图6:两段不同Poly A尾巴片段的原始质荷比图(单个和叠图)
2) 也可优化液相参数将两段加尾片段在UV和TIC图谱上进行分离,如图7所示。两段加尾片段的原始质荷比图和解卷积图谱见图8和图9。
▲图7两段加尾片段的TIC图谱
▲图8加尾片段1的原始质荷比图和解卷积图谱
▲图9加尾片段2的原始质荷比图和解卷积图谱
Poly A尾巴片段主要报告不同长度尾巴片段的占比,根据不同长度A在解卷积图谱上的响应值来计算。一般理论分子量和实际分子量的差值不超出2Da。
计算公式如下所示:
比例(%)=(X/S)× 100%
X:不同Poly A长度的峰高,不同的Poly A长度利用其分子量来区分。
S:所有检测到的不同Poly A长度的峰高之和。
三、常见疑问
Q
理论分子量和实测分子量对不上?
A
注意碱基是否有修饰,一般U碱基会进行甲基化修饰。
T1酶的特异性酶切位点是G碱基右侧的磷酸二酯键,尾部片段中G碱基在尾巴片段的左边和右边,理论分子量差值是80。
Q
如何获得完整的加尾片段?
A
可利用H酶的特异性,切割DNA和RNA 的杂交位点,但是会有多个切割位点。
先根据RNA的理论序列设计探针,在加尾片段的前段形成DNA和RNA杂交链;然后利用H酶的特异性获得完整的加尾片段。
Q
解卷积图谱中加合峰的来源?
A
化合物在质谱中出峰,大部分情况下是以加H+的模式,但是也有因为系统(流动相中、系统管路、六通阀、喷雾针等均可能)中或者前处理过程中有残留的金属离子,而形成金属离子加合峰的情况。
采用磁珠纯化过程中会使用到一些金属离子钠,锂,流动相中可能还会出现钾,这都可能会导致加合峰的产生。
同时,同一个仪器测试多个不同类型的项目,这种使用方式也可能会带来加合峰的产生。
Q
检测不到尾巴片段?
A
流动相在超声过程中,瓶子敞口,导致六氟异丙醇挥发。
操作环境的温度可能导致核酸降解。
四、微谱生物药技术研究平台
由于poly A分析一般目标分子量会超过1000nt,分子量比较大,因此这类检项要求实验室必须配置有高分辨质谱,目前我们配置有agilent的6545型和thermo fisher的QE型高分辨质谱,可以满足不同类型样品polyA的检测需求。
另外,此类方法申报一般对于周期的要求比较高,我们凭借丰富的项目经验,成熟的方法体系,迅捷的方法开发验证和检测周期,目前已助跑多款m-RNA产品申报进入决赛阶段。
微谱生物药技术研究平台始于与各大科研院所和高等院校的深度合作。依托微谱生物医药板块强大的仪器配置,完备的质量体系及多年积累的糖库,我们已经搭建出符合国际质量标准的生物制品研发分析与实验室服务平台,可以为客户提供专业的一体化生物制品质量研究服务。
蛋白多肽类药物结构表征
质量肽图、糖谱分析、高级结构、理化分析、产品变异性、生物学活性、产品相关杂质、工艺相关杂质
mRNA药物结构及关键质量属性
加帽率、Poly A 长度、金属残留、溶剂残留、蛋白酶残留、mRNA鉴别/含量/纯度/杂质、脂质鉴别/含量/纯度/杂质
参考文献:
[1]弗若斯特沙利文,mRNA技术:催生新一代疗法的医学革命
[2] 未来智库,医药行业mRNA产业链深度报告:第三代核酸疫苗技术颠覆性创新
关于微谱
微谱,大型研究型检测机构,是科技服务改变世界的践行者。凭借长期服务于先进制造、生物医药、美丽健康、生态环保、食品及农产品五大产业链所沉淀的行业技术解决方案,坚持以市场需求为导向,满足用户在研发创新、质量升级、节能减排、工艺改善、调查分析、质量鉴定、计量校准、体系或产品认证等多层面的个性化综合性科技服务需求;通过众多自主研发的分析检测测试方法,助力客户获取更大成功。微谱始终秉承“服务,不止于检测!”的理念,尽心尽力让科技进步更快,让产品质量更好,让人类生活更安全、更健康、更绿色!
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