质谱成像 | 莲不同组织中苄基异喹啉类生物碱的可视化和鉴定

莲是一种具有药用和营养价值的植物，其含有多种生物碱，如荷叶碱（Nuciferine）、N-去甲基荷叶碱（N-nornuciferine）、杏黄罂粟碱（Armepavine）和甲基莲心碱（Neferine）。这些生物碱在莲的不同组织中分布不同，但其合成途径和分布机制尚不清楚。因此，本研究旨在通过使用质谱成像技术和定量质谱分析，探究莲中不同生物碱在不同组织中的合成和分布，并推测其可能的合成途径。该研究对于优化药用植物的应用和促进食品资源的开发具有重要意义。

本研究的研究思路是通过使用质谱成像技术和超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术，研究荷叶、莲子心和莲乳汁中不同生物碱的生物合成和分布情况。

具体研究内容包括以下四个步骤：

1. 使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术分析荷叶、莲子心和莲乳汁中生物碱的化学特征，对这三种组织中生物碱的化学谱进行分析，了解它们的组成和含量。

2. 使用基质辅助激光解吸电离质谱成像技术对荷叶、莲子心和莲乳汁中生物碱的空间分布进行表征，确定生物碱在组织中的分布情况，从而了解它们在不同组织中的积累和分布差异。

3. 使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术对37个莲品种中生物碱的含量进行定量分析。通过对不同品种中生物碱含量的比较，了解不同品种之间的差异和变化趋势。

4. 推测生物碱的生物合成途径。通过对生物碱的分析和比较，可以推测出生物碱的生物合成途径，为进一步研究莲中生物碱的合成机制提供线索。

01

在荷叶、莲子心和莲乳汁中共鉴定出46种生物碱类化合物，包括了19种单苄基异喹啉类生物碱，10种阿朴菲类生物碱，2种双苄基异喹啉生物碱，以及其它类生物碱13种，化合物详情见表1。在这46种生物碱中，有21种生物碱首次在莲中被鉴定并进行报道，其中包括了9种糖基化单苄基异喹啉生物碱。9种糖基化单苄基异喹啉生物碱中有7种在莲子心中被检出，这也表明了莲子心是单苄基异喹啉类生物碱糖基化的主要位点。

表1 荷叶、莲子心和莲乳汁中生物碱的鉴定

注：LL：荷叶；LP：莲子心；LMS；莲乳汁

a：在莲花属植物中首次报道的生物碱

b：用标准品鉴定的化合物

02

如图1A所示，苄基异喹啉类生物碱表现出明显的特异性组织分布。双苄基异喹啉类生物碱，例如莲心碱/异莲心碱（31/32；[M + H]⁺  m /z 611.3108）和甲基莲心碱（33；[M + H]⁺  m /z 625.3266）主要在莲子心和莲乳汁中分布。在荷叶、莲子心和莲乳汁中都检测到了7种阿朴菲类生物碱，但其含量在莲子心中最低。O-去甲基荷叶碱/N-去甲基荷叶碱/北美鹅掌楸尼定碱（24/26/25；[M + H]⁺  m /z 282.1489）和去氢番荔枝碱（20；[M + H]⁺  m /z 264.1062）可以在荷叶中产生。此外，原荷叶碱（29；[M + H]⁺  m /z 312.1599）可能是由乳汁管产生并转移到其它组织。极少量的双苄基异喹啉类生物碱分布在荷叶中心，广泛分布在莲乳汁中，主要分布在莲子心周围，这个现象表明乳胶影响了双苄基异喹啉类生物碱的运输，这一特点与罂粟相似。有研究报道，荷叶碱（27；[M + H]⁺  m /z 296.1645）广泛分布在荷叶中，是荷叶所有生长发育阶段中最重要的生物碱。在荷叶和莲乳汁中也检测到了莲碱（23；[M + H]⁺  m /z 280.1342）。

以上结果表明，阿朴菲类和双苄基异喹啉类生物碱在莲各组织中的代谢是不同的，其中一些化合物是在组织的生长和发育过程中产生的。乳汁管和乳汁液对这些化合物的产生和运输具有不可或缺的作用。

莲子心中甲基化和糖基化单苄基异喹啉生物碱的特异性分布如图1B所示。值得注意的是，糖基化单苄基异喹啉生物碱不仅在莲子心周围检测到，在维管束中也有分布。N-甲基异衡州乌药碱-4´-O-葡萄糖苷（16；[M + H]⁺  m /z 462.2124）、N-甲基异衡州乌药碱-6-O-葡萄糖苷（17；[M + H]⁺  m /z 462，2136）、N-甲基异衡州乌药碱-4´-O-葡萄糖苷（19；[M + H]⁺  m /z 462.2144）和去甲基杏黄罂粟碱（18；[M + H]⁺  m /z 462.2113）与非糖基化的单苄基异喹啉类生物碱具有相同的富集规律。此外，在相同的位置检测到了N-甲基消旋乌药碱-7-O-葡萄糖苷（11；[M + H]⁺  m /z 448.1903）、N-甲基消旋乌药碱-4´-O-葡萄糖苷（12；[M + H]⁺  m /z 448.1917）、N-甲基消旋乌药碱-6-O-葡萄糖苷（13；[M + H]⁺  m /z 448.1976）、异乌药碱-葡萄糖苷（14；[M + H]⁺  m /z 448.1975）和衡州乌药碱-葡萄糖苷（15；[M + H]⁺  m /z 448.1989），表明这几种化合物可能参与了单苄基异喹啉类生物碱的糖基化。

图1 用MALDI-MSI法检测荷叶、莲子心和莲乳汁中的苄基异喹啉生物碱。LL：荷叶；LP：莲子心；LMS；莲乳汁。A：莲心碱和异莲心碱在三个组织中的分布；B：甲基化和糖基化单苄基异喹啉生物碱在莲子心中的分布。

03

对荷叶、莲子心和莲乳汁中的的46种苄基异喹啉类生物碱进行了定量分析。PCA结果显示，三个组织通过主成分2（PC2）得到明显分离。

如图2B所示，不同组织之间存在明显差异，荷叶靠近PC2轴的顶部，其特征是阿朴菲类生物碱含量高(占方差的19.1%)。莲乳汁则位于PC2轴的中间，其特征是较低水平的单苄基异喹啉类生物碱和较高水平的双苄基异喹啉类生物碱。莲子心位于第四象限，以双苄基异喹啉类生物碱和部分单苄基异喹啉类生物碱为特征。

如图3A所示，这些生物碱包含了糖基化和甲基化生物碱，它们可通过组织特异性变异来区分。此外，从图中还可看出三种双苄基异喹啉类生物碱（莲心碱、甲基莲心碱和nelumboferine），一种阿朴菲类生物碱（荷叶碱）和一种单苄基异喹啉类生物碱（异乌药碱）之间存在很强的正相关性。此外，两种糖基化双苄基异喹啉类生物碱（N-甲基消旋乌药碱-6-O-葡萄糖苷和N-甲基异衡州乌药碱-6-O-葡萄糖苷）单独聚在一起，并与N-甲基消旋乌药碱呈显著正相关。

图2 基于荷叶、莲子心和莲乳汁中生物碱含量的PCA图。A：得分图；B：载荷图。括号中的百分比表示主成分方差。LL：荷叶；LP：莲子心；LMS；莲乳汁。

37个莲品种的3个组织中的苄基异喹啉类生物碱含量如图3所示。荷叶中主要化合物为荷叶碱、N-去甲基荷叶碱、O-去甲基荷叶碱、去氢番荔枝碱、山矾碱，在大部分莲品种中，它们在荷叶中的含量都达到了60%以上。

莲子心中主要化合物为nelumboferine、甲基莲心碱、莲心碱和异莲心碱以及杏黄罂粟碱、衡州乌药碱和异乌药碱，在大部分莲品种中，它们在莲子心中的含量都达到了80%以上。

莲乳汁中主要化合物为莲心碱和甲基莲心碱，在部分莲品种中，它们的含量几乎接近90%。如图3B所示，阿朴菲类生物碱和单苄基异喹啉类生物碱是荷叶中的主要生物碱。单苄基异喹啉类生物碱和双苄基异喹啉类生物碱是莲子心中的主要生物碱。与其他两个组织相比，莲乳汁中生物碱的种类更为丰富，包括单苄基异喹啉类、双苄基异喹啉类、阿朴菲类等。

图3 37个莲品种中生物碱的半定量结果（A）和相对含量（B）

04

该研究基于荷叶、莲子心和莲乳汁中检测到的苄基异喹啉类生物碱推测了其生物合成途径，如图4所示。去甲基衡州乌药碱、衡州乌药碱、N-甲基衡州乌药碱和网状番荔枝碱是以L-酪氨酸为底物，在碎叶紫堇碱合成酶（Cheilanthifoline synthase）、N-甲基人血草碱-14羟化酶（N-methylstylopine-14-hydroxylase, MSH）、O-甲基转移酶（O-methyltransferase, OMT）、N-甲基转移酶（N-methyltransferase, NMT）、作用下生成的。该途径分为三个亚途径，分别合成双苄基异喹啉类生物碱、阿朴菲生物碱和单苄基异喹啉类生物碱。(S)-紫堇块茎碱合成酶（(S)-corytuberine synthase, CYP80G)催化N-甲基异衡州乌药碱生成阿朴菲类生物碱。此外，5种高含量的阿朴菲类生物碱（番荔枝碱、山矾碱、O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱、荷叶碱）也参与了其合成途径。同样的底物，N-甲基衡州乌药碱可以利用小檗碱合成酶（Berbamunine synthase, CYP80A）生成双苄基异喹啉类生物碱。莲心季铵碱与N-甲基消旋乌药碱-6-O-葡萄糖苷（r=0.92）、N-甲基异衡州乌药碱-6-O-葡萄糖苷（r=0.81）呈显著正相关。此外，单苄基异喹啉类生物碱合成途径上产生的去甲基衡州乌药碱、异乌药碱、杏黄罂粟碱和莲心季铵碱也表现出很强的正相关性（0.5 < r < 0.92）。相反，苄基异喹啉类生物碱合成的主要前体物质L-酪氨酸与衡州乌药碱（r=-0.79）、荷叶碱（r=-0.87）呈显著负相关。该研究还指出O-甲基转移酶和N-甲基转移酶参与了莲苄基异喹啉类生物碱的修饰。甲基化参与了大多数单苄基异喹啉类生物碱的代谢，通常只发生一次。糖基化主要发生在莲子心中，多发生在单苄基异喹啉生物碱的O位和N位第一次甲基化之后。

图4 莲中苄基异喹啉类生物碱的预测生物合成途径。

化合物编号与表1一致。

该研究利用UPLC-QTOF-HRMS鉴定出46种生物碱，其中9种为糖基化单苄基异喹啉类生物碱，并通过MALDI-MSI鉴定出这些生物碱分布在莲的不同组织(荷叶、莲乳汁和莲子心)。这些结果直接证明了这些生物碱在各种莲组织中的分布差异，并进一步证明了次生代谢产物在植物抗逆性中的作用。此外，糖基化代谢物的定位也存在差异，主要分布在莲子心维管束附近。这些发现为糖基化天然产物的开发和应用奠定了基础。此外，37个代表性莲品种间苄基异喹啉类生物碱含量的相关性也为苄基异喹啉类生物碱的生物合成提供了线索。

该研究对于莲中生物碱的合成途径和代谢机制的揭示，为进一步研究和利用莲的药用和营养资源提供了新思路和理论基础，为莲的种植选择、育种和功能食品开发提供了科学参考和指导，丰富了对于植物中生物碱合成和分布的认识，对于其他植物的生物活性成分研究和利用具有借鉴意义。

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