2023-11-25 21:22:44, 蔡斌 艾杰尔-飞诺美(Agela & Phenomenex)
色谱工作者经常面临的共同挑战之一是在典型的反相流动相条件下实现极性分子有可接受的保留,以应对后续分析或分离的要求。在处理极性碱性分析物时,最常遇到此类问题,分析物在低pH流动相条件下电离,而流动相条件通常采用反相方法。在开发LC-UV方法时,分析人员可以添加各种离子对试剂,如己烷磺酸,以显著提高这些类型分析物的保留时间。然而,因为它们是非挥发性的,离子对试剂与质谱不相容,并且具有很强的离子抑制作用。因此,它们在LC-MS方法中很少使用。
即使对于LC-UV方法,离子对试剂在方法稳定性和重现性方面也可能存在问题,因为流动相中离子对试剂浓度的微小变化会强烈影响分析物的保留时间。随着时间的流逝,这些离子对试剂会在色谱柱内积聚,固定相的化学性质被累积的离子对试剂改变,导致保留时间逐渐漂移。
为此,许多色谱填料制造商开发了独特的固定相,专门设计用于提高大极性分子的保留和选择性。这些类型的固定相通常包含嵌入的极性官能团,或者以极性官能团作为封端试剂。无论哪种方式,相对于C18,极性改性的固定相通常具有两个优点。首先,极性修饰的固定相可提供在100%水相流动相中保持稳定性。典型的C18固定相在有机溶剂含量低于5%的流动相中不稳定,当暴露于或储存在100%缓冲体系条件下时,会显示出灾难性的保留损失。其次,极性修饰通常为大极性分析物提供更高的保留和独特的选择性,因为它们可以提供除了疏水性相互作用之外的次级相互作用。使用水相高的流动相结合次级作用,通常可以提高极性碱性化合物的保留时间。
案例一
如何利用这一特性分析极性化合物
图1 某品牌1.7μm C18
图2 Luna® Omega 1.6μm Polar C18
图3 Luna® Omega 1.6μm Polar C18
起始流动相=100%水(0.1%FA)
流动相A为含0.1%甲酸的水,流动相B为含0.1%甲酸的乙腈。在图1和图2中,梯度从3%有机相比例开始,条件适用于标准C18固定相。在这些条件下,您可以看到,与标准C18固定相相比,极性改性的Luna® Omega 1.6µm Polar C18固定相的保留略强于图1。然而,当我们利用Luna® Omega Polar C18表面改性提供的100%水相稳定性能时,您可以看到保留时间的显著提高,这对于将目标分析物从早期抑制区移开以提高定量和灵敏度至关重要。
色谱条件:
色谱柱:按照说明
规格:50x2.1mm
流动相:
A: 0.1%甲酸-水
B: 0.1%甲酸-乙腈
梯度:
Time (min) | %B |
0 | 3 (除特别注明) |
3 | 100 |
流速:0.4mL/min
温度:40℃
检测:MS/MS
样品:
1. 去甲肾上腺素
2. 肾上腺素
3. 去甲变肾上腺素
4. 多巴胺
5. 变肾上腺素
目前在药物研发的进程中,有了分析方案,也经常有需要放大到制备纯化甚至中试工艺以上的生产项目,比如现在正火热的多肽、修饰核苷酸类。分析固定相均为小颗粒,无法直接放大,并且出于成本考虑,一般需要使用专为纯化放大设计的大粒径硅胶填料,比如10μm的AQ C18反相色谱填料。
Agela全新推出的Venusil AQ C18(3) 10μm填料是一款专门为100%水相条件下使用而设计的反相C18硅胶填料。其采用先进的键合工艺,对于强极性化合物,拥有与传统C18不同的选择性和分离能力,可以轻松分离多肽、寡核苷酸、单体核苷酸等极性物质。
作为一款适合分离纯化极性化合物的填料,耐水的性能是AQ C18寿命的重要保障。Venusil AQ C18(3) 10μm填料经过特殊优化处理,能长时间耐受100%水相流动相,即便是在100%水相中长时间存放,性能也基本不变。
pH=6.9的100%水相流动相寿命测试
色谱柱:Venusil AQ C18(3), 10μm, 120Å
规格:4.6x150mm
流动相:100%K2HPO4 (20mM, pH=6.9)
流速:1.0mL/min
柱温:30℃
样品:
1. 胞嘧啶
2. 尿嘧啶
3. 胸腺嘧啶
4. 腺嘌呤
pH=2的100%水相流动相寿命测试
色谱柱:Venusil AQ C18(3), 10μm, 120Å
规格:4.6x150mm
流动相:
A: 0.1%甲酸-水
B: 0.1%甲酸-乙腈
流速:1.0mL/min
柱温:30℃
样品:
1. 尿嘧啶
2. 邻苯二甲酸二甲酯
3. 对羟基苯甲酸丁酯
4. 萘
5. 阿米替林
梯度:
Time | B% |
0 | 5 |
1 | 5 |
15 | 95 |
20 | 95 |
20.5 | 5 |
30 | 5 |
案例二
某小分子多肽类的化合物粗品纯化
色谱柱:Venusil AQ C18(3), 10μm, 120Å
规格:21.2x250mm
流动相:
A: 水 (0.1%TFA)
B: 甲醇
流速:15mL/min
柱温:25℃
检测波长:
220nm (红色信号线)
280nm (蓝色信号线)
进样量:100mg
一次纯化收率:84%
梯度:
Time | B% |
0 | 20 |
40 | 60 |
该样品粗品及纯化后的分析谱图如下:
色谱柱:Venusil AQ C18(3), 10μm, 120Å
规格:4.6x150mm
流动相:
A: 水 (0.1%TFA)
B: 甲醇
流速:1mL/min
柱温:30℃
检测波长:220nm
进样量:30μL
梯度:
Time | B% |
0 | 0 |
30 | 80 |
案例三
分离CTGA四个核苷酸
色谱柱:Venusil AQ C18 10µm 21.2×250mm
流动相:
A: 水 (50mM甲酸铵)
B: 甲醇:水=20:80
流速:20mL/min
波长:260nm, 280nm
进样量:1400µL (100mM单体CTGA各100µL混合后加流动相A 1mL)
Time | B% |
0 | 0 |
11 | 0 |
20 | 100 |
Agela AQ C18 10µm填料,用甲酸铵的方法可以完全分离CTGA四个核苷酸。
产品信息:
*详情咨询当地销售
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