2023-11-25 13:56:13, 上海应用部 月旭科技(上海)股份有限公司
核糖核酸酶A
核糖核酸酶A(Ribonuclease A,缩写RNase A),是一种含4个二硫键的单链多肽,分子量约为13.7kDa(氨基酸序列)。RNase A是一种核糖核酸内切酶(endoribonuclease)。
核糖核酸酶层析纯化思路
提取及粗纯方案
我们基本采用牛胰腺硫酸铵盐析粗提物(由McDonald根据Kunitz氏纯化方法修改,“Methods in Enzymology”,Vol.ⅡP429,1955.)。
精纯方案
我们使用CM Tanrose 6FF为层析介质。这是月旭科技研发的一款高流速琼脂糖基架弱阳离子交换介质填料。以6%高度交联的琼脂糖为基架的介质,平均粒径及粒径范围分别为90μm,45-165μm,具有流速快、分辨率高的优点,是大规模生物分子分离纯化的首选介质。洗脱后的核糖核酸酶A纯度可提升至71~86%,并通过进一步去杂后,最终纯度大于95%,最终收率约56%。
下面分享一下层析条件▷
层析柱填料:CM Tanrose 6FF(货号:00062-53002)。
样品:牛胰腺粗品(含多种杂蛋白)。
程序运行:
缓冲液B,3CV,2.5mL/min
↓
缓冲液A平衡,13CV,2.5mL/min
↓
上样环上样,2.5mL/min
↓
缓冲液A洗杂,8CV,2.5mL/min
↓
缓冲液B线性梯度洗脱,0-40%B,10CV, 2.5mL/min
离子交换层析结果分析
对层析上样液,洗脱液进行SDS-PAGE电泳跑胶,通过凝胶成像仪分析。
图1:核糖核酸酶A经离子交换层析纯化图谱
图2:层析柱上样液
图3:层析柱洗脱液
图4:经后续纯化处理后
样品经层析纯化后,通过SDS-PAGE数据分析可知:经一步层析纯度提升至82.4%,显示了填料的高分辨率。
结论
通过对牛胰腺盐析粗提物处理,上样CM Tanrose 6FF进行RNase A的分离纯化,其纯度得到了很大的提升,去除了较多的杂蛋白,经后续一定的处理后,跑SDS-PAGE胶,凝胶成像仪分析显示单一条带,符合纯化要求。
作者:余新勇
排版:吴梦琳
审核:栾建明
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