【知识库】如何做到蛋白质电泳迁移率的精确可重复性测量？

开发基于蛋白质的产品需要了解它们在溶液中的表现，而测量样品的Zeta电位可通过预测聚集行为，研究蛋白质制剂的稳定性。但在实际测量过程中，Zeta电位明显变化并不是电场本身导致了蛋白质的聚集，其变化的真正原因是蛋白质与电极的接触导致。

本文将介绍一种新的方法：扩散屏障法，可以提高测量样品Zeta电位时的准确性和可重复性。

扩散屏障法通过引入一个较小的样品量，用溶解蛋白质的相同缓冲液将样品与电极分离，因此电极对蛋白质的影响大大降低。由于这种保护仅由样品与电极的距离提供，在样品扩散到电极之前，样品都不会受其影响。而这一过程可能需要数小时，因为只测量了可溶性天然蛋白的迁移率，使得样品的测量结果更加可靠。

一、样品装载

首先将溶解蛋白质的缓冲液注入折叠毛细管样品池中。然后将样品池放入Zetasizer纳米粒度电位仪中静置2至3分钟，使其温度达到平衡。这将减少任何与温度有关的流体运动，如对流。然后取出样品池，通过图1所示的枪头将20~100 μL的样品直接注入毛细管样品池的最底部（图2）。

图 1 200μl的凝胶上样移液枪头

图2 折叠毛细管孔中的凝胶移液枪头，用于装载扩散屏障方法的样品量

图3 装样对比图：在10 mM NaCl中完全充满蓝色葡聚糖的样品池（左）；样品池填充10 mM NaCl，并加入50 μl蓝色葡聚糖作为扩散屏障（右）

很明显，样品的蓝色部分位于样品池的测量体积中，距离样品池顶部的电极有相当大的距离。如果样品池保持直立并小心处理，样品将不会在样品池内部扩散。在开始测量之前，应使温度达到平衡。

二、迁移率测量

理论上，使用扩散屏障法进行迁移率测量与在Zetasizer Nano中进行常规测量完全相同。在实际测样过程中，离子强度较高的缓冲液会有较高的电导率，导致在给定电压下焦耳加热增加。需要进行一些手动改进，以提高使用扩散屏障法进行测量的数据质量。

为了避免显著的焦耳热，应根据所使用的缓冲液的导电性来选择电压。如表1所示，在软件中自动选择适当的电压，随着缓冲盐的浓度增加，所用的电压降低，并且运行次数最多为20次，以尽量减少焦耳热。建议在两次测量之间设置180秒的延迟，这也是为了确保测量之间的温度平衡。

表1：给定浓度缓冲液的建议电压和最大运行次数

Zetasizer软件版本7及以上的蛋白质迁移率测量类型将使所有这些设置自动化，使测量尽可能简单。

一，粒径分布变化

建议在zeta电位测量之前和之后都进行粒径测量，以检查样品是否因电位测量而发生变化。如果迁移率测量影响了样品并导致其聚集，这些聚集应该出现在迁移率测量后的尺寸测量数据中。图4A显示了在任何迁移率测量之前的粒径测量示例。该样本不含聚集体，PDI为0.05。在常规的zeta电位测量后，聚集体已经形成，PDI接近0.2（图4B）。然而，当采用扩散屏障法时，没有形成聚集体，迁移率测量后的PDI仍然低于0.05（图4C）。

图4A 样品迁移率测量前的粒径分布

图4B 样品常规迁移率测量后的粒径分布

图4C 使用扩散屏障法测量迁移率后的粒径分布

二、频率分布的对比

样品中的聚集体将具有较低的布朗运动速度，从而在频率图中产生一个尖锐的峰值。因此，频率图中出现宽峰是识别高质量数据的好方法。

图5显示了蛋白质迁移率测量的两个频率图。图5A显示了使用扩散屏障法重复测量的频率宽峰，连续测量的图重叠良好，表明没有聚集物存在。图5B显示了未使用扩散屏障法的连续测量叠加图。第一个测量是红线，它显示了广泛的分布和良好的测量。然而，随着测量的进行，由绿蓝线和黑线表示，很明显，一个大而尖锐的峰正在形成，这代表了在测量过程中聚集的样品。多次测量的图不一致，因此无法获得可重复的迁移率测量。

图5A 使用扩散屏障法进行的连续测量的频率图

图5B：常规迁移率测量的频率图

焦耳热是测量重复性下降的原因之一，而通过电导率的测量可以有效识别焦耳热。为了尽量减少焦耳热的影响，电导率应限制在连续测量之间的增加不超过5-10%。如果它的增加超过这个值，则表明已经发生了明显的加热，这可能会影响样品并降低测量的可重复性。

至少要进行5次测量，以确保数据是可重复的。在方法开发过程中，建议测试一种廉价的替代蛋白质，以优化方法。