每日小技巧——如何选择正相色谱的条件

什么是正相色谱

液相色谱有很多分离模式，其中正相色谱分离模式是最先被发明出来的，它的特点是色谱柱中的固定相的极性大于流动相的极性。正相色谱的保留作用主要是亲水作用力，流动相的洗脱顺序是从小到大，而键合有烷基的材料，保留主要是依赖于疏水作用，洗脱顺序相反，所以叫做反相。

在正相色谱中，流动相是弱极性的比如正己烷、石油醚等，而固定相是极性的，比如氰基、氨基、硅胶、以及HILIC和大部分手性柱都是正相色谱的范畴。

正相色谱可用于分离中性或离子样品，但中性样品为主。在分离离子样品时，通常在流动相中加入二乙胺或三乙胺等碱性添加剂来分离碱性化合物或加入甲酸、乙酸、TFA等酸添加剂来分离酸性化合物。

那么在什么情况下需要使用正相色谱呢？

1）样品在反相色谱中不保留（亲水性太强)。

2）样品在反相色谱中保留太强（疏水性太强）。

3）采用反相条件不能获得足够的分离度。

4）分离空间异构体、立体异构体或非对映异构体。

5）期望回收大量疏水性样品组分（主要用于制备色谱）。

6）样品溶于非极性溶剂（若样品直接进样且采用反相色谱柱会严重损伤该色谱柱）。

正相色谱流动相的选择

一般都是用一种弱极性和强极性溶剂混合获得中等极性的流动相，然后根据目标分离物的保留时间和分离度3倍原则去调整两相比例和类型，从而达到合适的保留值和分离度。

对于正相填料（如硅胶），溶剂洗脱能力由强到弱依次为：水>甲醇>异丙醇>乙腈>丙酮>乙酸乙酯=乙醚>四氢呋喃>二氯甲烷>氯仿>甲烷>正己烷。

常用溶剂的极性顺序为：石油醚＜已烷＜环已烷＜四氯化碳<三氯乙烯<二硫化碳<甲苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮<丙醇<乙醇＜甲醇＜乙腈＜水<吡啶<乙酸。

对于正相色谱最常用的流动相为烷烃（正己烷、正庚烷等）-异丙醇，需要注意的是，在正相色谱中，是不用缓冲盐的，因为正相色谱流动相一般只用有机溶剂，不用水相，缓冲盐不溶解，根据样品的结构，酸性样品加入甲酸、乙酸、TFA等来调节pH。碱性样品则加入二乙胺或三乙胺等来调节pH。

正相色谱柱的选择

常用正相色谱柱有氰基柱、硅胶柱、二醇基柱和氨基柱，色谱柱强度顺序为：硅胶柱≈氧化铝>氨基柱>二醇基柱>氰基柱。异构体分离宜采用硅胶柱。

月旭经典正相色谱柱选择指南

USP编号	型号	特点
SiO₂ (L3) 硅胶柱	Ultimate® SiO₂ (pH2.0-8.0)	■ 采用B型超纯全多孔球形硅胶(纯度>99.999%)低酸性，低金属含量。 ■ 正相和反相模式均可使用，特别适合应用于容易拖尾的极性化合物的分离。
SiO₂ (L3) 硅胶柱	Topsil® Silica (pH2.0-8.0)	采用与Ultimate不一样的硅胶基质，比表面积较低，同等价格中性能超前。
NH₂ (L8) 氨基柱	Topsil® NH₂ (pH2.0-8.0)	■ 用于正相、反相、弱阴离子交换。 ■ 正相洗脱条件下分析极性化合物,生育酚和一些可溶解在烷烃、烯烃、和芳香烃中的有机化合物。 ■ 在低pH的缓冲溶液中，为弱的阴离子交换能分离一些带负电荷的分子，不衍生的情况能分离氨基酸。
CN (L10) 氰基柱	Ultimate® XB-CN (pH1.5-9.0)	■ 适用于在C18上没有保留或保留太强的物质。 ■ 在正相色谱中氰基键合相可以替代硅胶，能较快平衡、比非衍生硅胶表面活性更一致的特点。 ■ 可以同时用于反相正相，CN键合相中普适性最强的系列，首选柱。
Diol (L20) 二醇基	Ultimate® Diol (pH2.0-8.0)	■ 相对于硅胶柱和氨基柱，是稳定性和重现性好得多的正相柱，在纯硅胶基础上的改良，对部分化合物，可提供更优的选择性和色谱峰形。 ■ 独特的键合技术，保证固定相结构稳定，严格的工艺过程，保证了优良的批与批重现性高柱效，较长的使用寿命。