磺酸酯类基因毒杂质检测方法

在制药行业中，磺酸或磺酰卤类试剂常被用作烷基化试剂和催化剂，还常应用于药物化学合成的纯化或成盐步骤。合成反应或重结晶步骤中任何残留醇的存在都可能导致形成磺酸酯。临床研究发现磺酸酯能够直接与生物大分子（DNAs、RNAs及蛋白质）发生烷基化反应，可能会导致DNA 的突变。甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯及甲磺酸异丙酯已被证明具有基因毒性，而其他具有磺酸基的物质可能存在潜在基因毒性，对人类健康造成威胁。因此，利用各种分析技术手段研究检测磺酸酯的限度是非常必要的，对于此类基因毒性杂质的测定，除了需要克服灵敏度、选择性以及样品基质干扰等挑战外，磺酸酯的高反应活性也为分析方法的开发带来了难度。

磺酸酯根据取代基不同可分为烷基磺酸酯和芳基磺酸酯。烷基磺酸酯，如甲磺酸甲酯（MMS）、甲磺酸乙酯（EMS）、甲磺酸异丙酯（IMS）、甲磺酸正丁酯（NBMS）等；芳基磺酸酯，如苯磺酸甲酯（MBS）、苯磺酸乙酯（EBS）、对甲苯磺酸酯（MP-TS）等。这些磺酸酯是由甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸与甲醇、乙醇或其它低级醇结合而形成的。药物活性成分如以烷基磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐及羟乙基磺酸盐形式存在或药物合成过程中使用到了磺酸类试剂，磺酸酯就会被视为潜在的基因毒性杂质而存在。

按照美国FDA和EMEA指南的要求（点击查看：基因毒性杂质面临国际法规的巨大挑战），必须对原料药或药品中任何可能存在、未在早期合成步骤中清除的所有基因毒性杂质进行监测。对于基因毒性杂质来说，限度则需控制到ppm级别，所以基因毒性杂质的标准比普通杂质严格了近百倍乃至千倍。

常用的检测方法

烷基磺酸酯类化合物沸点较低，适合用GC法测定。目前欧洲药典( EP) 已经给出了通用的基因毒性杂质检测方法，利用GC 方法分别针对活性成分中的甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸异丙酯及甲磺酸酰氯进行检测。但常规的GC法灵敏度较低，较难达到痕量基因毒性杂质检测限度的要求，目前常采用GC-MS法来测定磺酸酯类杂质。芳基磺酸酯类化合物的沸点较高，不适合采用GC法测定，故常采用高效液相色谱法进行测定。为进一步提高检测的灵敏度，现在多采用LC-MS、和LC-MS/MS方法进行测定。 

提为进一步提高检测灵敏度，提高样品的稳定性，避免发生降解反应，可以对样品进行适当衍生化处理后，再采用GC-MS、LC-MS等方法进行分析，便于检测。欧洲药典8.0中使用碘化钠为衍生化试剂，采用HS-GC-MS法来测定甲磺酸倍他司汀中的甲磺酸甲酯( MMS) 、甲磺酸乙酯( EMS) 及甲磺酸异丙酯( IMS)。

提供以下两个案例可供借鉴:

苯磺酸氨氯地平，是氨氯地平的苯磺酸盐，是一种长效钙通道阻滞剂，可用于疗高血压。氨氯地平在合成过程中使用到了溶剂正丙醇或异丙醇，而在与苯磺酸成盐时，用甲醇作为氨氯地平与苯磺酸的反应溶剂，乙醇作为最终重结晶的溶剂。因此在整个合成过程就有可能中形成具有潜在基因毒性的苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯及苯磺酸异丙酯。因此，必须监测该类药物中是否存在这些化合物。该药物一般通过口服摄入，最大每日剂量为10 mg，对应的四种基因毒性杂质的总TTC水平为150 ppm。

因此，利用HPLC-UV的方法同时测定四种杂质，根据ICH指南要求，对方法进行了检测限（LOD）、定量限（LOQ）、线性、精密度、准确性等相关验证，该方法灵敏度高、操作便捷且无任何干扰，在该方法下四种基因毒杂质的检测限分别为7ppm、11ppm、12ppm和9ppm，均能达到检测的需求。

甲磺酸伊马替尼是酪氨酸激酶抑制剂，由FDA批准上市，用于治疗胃肠道基质瘤和慢性粒细胞性白血病加速期、急变期和慢性期干扰素耐药的患者。因甲磺酸伊马替尼在合成过程中，需要将伊马替尼和甲磺酸分别溶于甲醇后进行反应，反应结束后，除去甲醇，再加入乙醇回流溶解，最后放置冰浴中析晶，得到成品。所以，在成盐及纯化过程中有可能会生成甲磺酸甲酯（MMS）和甲磺酸乙酯（EMS）。MMS和EMS已经被证实具有遗传毒性和致癌性，尽管甲磺酸伊马替尼可以抑制癌细胞的生长，但MMS和EMS的基因毒性可能会增加用药的风险。依据EMA和FDA相应的指导原则，有必要对苯磺酸伊马替尼中的MMS和EMS进行定量分析。

因此，利用GC-MS的方法进行检测，该方法在现有的方法上进行了优化，省去了衍生化复杂的操作步骤，直接进样检测。该方法选择正己烷为溶剂，解决了样品溶解度问题且无基质干扰，在该方法下MMS和EMS的检测限均为0.3μg/mL，两种杂质在1~15 μg/mL的浓度范围内均成良好的线性关系，相关系数R2>0.999，收率在98.1%~99.6%之间，符合检测的要求。

总结：

磺酸酯类化合物作为潜在基因毒性杂质，从很多方面都可能引入，可以从以下几个方面考虑来进行管控：a.对起始物料（如甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、羟乙基磺酸）中是否含有烷基磺酸酯或芳基磺酸酯杂质进行检查；b. 对药物活性成分的生产过程进行监测，检查在甲磺酸、羟乙基磺酸、苯磺酸或对甲苯磺酸及相应的酰氯存在的情况下是否使用了低级醇；c. 确认生产过程中接触到磺酸类试剂的设备清洗程序中是否有涉及到低级醇的使用；d. 在制剂过程中如制粒、压片时是否使用了低级醇等试剂。因此，杂质的研究必须要全面，这就要求我们对整个可能会产生的环节进行详细的控制，加强要求和监管，从而能够规避很多不可预见的风险。

工艺控制是避免产生基因毒杂质的根本性解决方法，而方法检测则是一个概率性抽检的事情。将两者完美相结合，就能达到我们最终的要求。另外值得注意的是，同样的药物因合成工艺不同，则存在的基因毒杂质也不同，因此需要建立适宜的分析方法和质量标准来证实药物活性成分中的烷基磺酸酯或芳基磺酸酯杂质是否处于毒理学阈值（TTC，Threshold of Toxicological Concern）以下。