氨基酸分析仪检测透明胶质类中的游离氨基酸

一、样品前处理

1、所用试剂

1.1 Loading Buffer：锂盐系统，pH 2.2

1.2 磺基水杨酸溶液：取50g磺基水杨酸溶于1L纯水中

1.3 乙二胺四乙酸二钠溶液：取10g EDTA-Na溶于1L纯水中

1.4 0.06mol/L 盐酸：取50mL 盐酸加水稀释至10mL,混匀

1.5 5种氨基酸标准品、Cystine单标

2、前处理设备

1) 分析天平:精度为 0.0001g

2) 移液枪及枪头

3) 0.22um滤膜

4) 一次性注射器

5) 低范围pH试纸

3、样品制备（参考NY/T 1975-2010）

因样品为透明胶质类物质，且可能含有未知大分子等杂质，故需(参考NY/T 1975)进行除蛋白前处理：

吸取2 mL样品于10 mL离心管或试管中,准确加人2 mL磺基水杨酸溶液(1.2)，混匀,放置1h。准确加入1 mL EDTA-Na溶液(1.3)和1 mL盐酸溶液(1.4),混匀,离心15 min(或用0.45um的微孔滤膜过滤)。吸取上清液(或滤液)1 mL(测定当前pH，若有需要则可加少许的Loading Buffer (1.1),使氨基酸浓度处于仪器最佳检测范围内)，移液枪取上述溶液1mL至一次性注射剂，过滤膜，上机待测。

二、分析方法描述（Biochrom 30+）

氨基酸分析仪分析方法参数：

1) 色谱柱：Biochrom Li型阳离子交换树脂柱，4.6*20cm

2) 分离程序：

3) 运行时间：经分析时间+再生时间 168.15min

4) 反应单元温度：135°C。

5) 检测波长：570nm、440nm同时检测。

三、样品中氨基酸含量的计算

样品测定液氨基酸的含量按式(1)计算:

C_i = C_s/A_s × A_i× F ················· (1)式中:

C_i ———样品测定液氨基酸i的含量,单位为纳摩尔每毫升(nmol/mL);

C_s ———氨基酸标准工作液氨基酸s的含量,单位为纳摩尔每毫升(nmol/mL);

A_i ———试样测定液氨基酸i的峰面积;

A_s ———氨基酸标准工作液氨基酸s的峰面积;

F ———样品稀释倍数。

附：透明胶质类物质中，高温灭菌前后比较的游离氨基酸，分析图谱及做样结果：

由结果可知：高温灭菌之后的游离氨基酸含量，相较于灭菌前会有少许提升。这是由于灭菌前的样品中可能含有的少许干扰物质或杂菌，存在经过高温灭菌等的处理会被破坏，释放少许的氨基酸的可能，属合理正常现象。

图1.  样品A--灭菌前—Tau、Glu、Gly、Val+Cystine

图2.  样品B--灭菌后—Tau、Glu、Gly、Val+Cystine