Clarity Oligo-RP用于PCR引物和探针试剂的纯度分析

2023-08-11 20:18:38, 薛静晶艾杰尔-飞诺美（Agela & Phenomenex）

飞诺美Clarity Oligo-RP色谱柱系列，专为寡核苷酸的反相纯化而设计，填料采用有机杂化TWIN技术，在添加离子对试剂的反相模式中实现均衡的疏水选择性和极性选择性，适合各类寡核苷酸的分离与纯化。该系列提供3μm、5μm和10μm三种粒径及各种规格，从分析到制备纯化轻松实现方法放大。

Clarity Oligo-RP用于PCR引物和探针试剂的纯度分析实例

PCR引物及探针的质量对于样本扩增以及靶标检测的准确性，起到了极其关键的作用，这对引物及探针的纯度这一指标提出更高的要求。因此，分析引物和探针的质量并确保其具有适当的纯度尤为重要。本应用中，采用离子对反相⾊谱(IP-RPLC)对PCR引物及探针纯度进行分析。离子对反相⾊谱(IP-RPLC)流动相包含离⼦对试剂（通常为烷基胺），可吸附在C18固定相上，从⽽引⼊了⼀种类似混合模式的保留机制，引物和探针中磷酸基团的电负性和荧光基团的疏⽔性均参与IP-RPLC的保留。

待测样品

样品为客户提供，并根据制造商的使用说明进行储存。

样品名称	序列（从5''到3''）
探针1	Cy5-TGTAAAACGACGGCCAGT
探针2	Cy5-CAGGAAACAGCTATGACC
正向引物	TCTACTAATTAATTGGTATT
反向引物	AATACCAATTAATTAGTAGA

色谱条件

色谱柱: Clarity Oligo-RP (4.6×150mm, 3μm, 100Å)

P/N: 00F-4441-E0

流动相:

A: 100mM HFIP 15mM TEA

B: 甲醇

流速: 0.5mL/min

波长: 260nm

柱温: 50℃

进样量: 5μL (10μmol)

梯度程序: 0-30min, B 15%-25% (引物), B 30%-40% (探针)

分析结果

引物、探针纯度分析：

样品名称	主峰纯度(%)
探针1	92.4
探针2	95.1
正向引物	91.3
反向引物	93.0

色谱图

图1 反向引物谱图

图2 正向引物谱图

图3 探针1谱图

图4 探针2谱图

小结

本应用案例使用Clarity Oligo-RP(4.6×150mm, 3μm, 100Å)，采用具有出⾊灵敏度和分离度的离子对反相色谱模式，对PCR引物和探针进⾏质量评估，所有引物和探针均产⽣了尖锐、对称的峰，杂质也得到了较好的分离，引物和探针的纯度都是90%以上。该方法能满足引物和探针纯度的检测。

附录1：

Clarity Oligo-RP用于寡核苷酸的杂质和失败序列纯化实例

Oligo-RP填料经过专门设计，能够适应核苷所有可能的相互作用特性，具有与自身匹配的反应性模式。吸附剂具有疏水、偶极、π-π和氢键供体/受体位点；这种相互作用组合以及离子对试剂可在核酸之间实现高度的差异选择性。因此，这种填料可以识别核苷酸序列间的极细微变化，例如一个碱基差异(N和N-1)或者一个碱基替换。

从分析到制备纯化的方法转移

目标N序列中N-1失败序列的分离
Column:	Clarity 3μm Oligo-RP C18
Dimensions:	A: 50x10.0mm	B: 50x4.6mm
Part No.:	A: 00B-4441-N0	B: 00B-4441-E0
Mobile Phase:	A: 50mM TEAA pH7.5	B: Methanol
Gradient:	10% to 60% B in 20 minutes
Flow Rate:	A: 4.7mL/min	B: 1.0mL/min
Detection:	UV @ 260nm
Sample:	20nt DNA