合成多肽的反相纯化 | 艾塞那肽纯化案例

2024-05-13 14:10:37, 市场部 艾杰尔-飞诺美(Agela & Phenomenex)


合成多肽的粗品纯化通常采用多步纯化过程。第一步除去大多数杂质,然后是通过二次精纯以达到所需的纯度。如果工艺合适,单步纯化即可完成的话,可以节省大量时间和成本达到必要的纯度,同时保持理想的收率和上样量。如果使用相同的固定相进行多步纯化,与使用多种固定相相比,也可提供可观的时间和成本的节省。

当采用多步色谱纯化时,常规构思是使用两种或两种以上的互补模式色谱,比如离子交换凝胶渗透、亲和,和反相配合,以利用它们不同的选择性。改变固定相是一个获得不同的选择性的有效方法,但这会让大批次的纯化成本提高,耗时增加。通常来说,多肽的性质允许调整pH值或选择不同的有机溶剂以达到改变选择性的目的,而这些改变的成本相对较低而且很容易实现。

艾塞那肽(Exenatide)纯化案例

艾塞那肽(Exenatide)是一种由39个氨基酸组成的多肽类胰高血糖素激动剂,于2005年4月被批准用于治疗糖尿病2型,化学结构如图1所示。

图1.艾塞那肽的化学结构式

Luna 10μm-PREP C8的流动相筛选

艾塞那肽是相对非极性的,首选Luna C8作为固定相,并用乙腈作为强溶剂。目标物的等电点为4.38,包含6个酸性侧链和4个碱性侧链,推断pH值变化可能改变艾塞那肽及其相关杂质之间的选择性。初步筛选评估4种不同的水相【pH值范围为2-8】(图2)。

色谱柱:Luna 10μm-PREP C8(3) 100Å

规格:250x4.6mm

货号:00G-4623-E0

流动相:

A: 如图所示

B: 100%乙腈

流速:1.5mL/min

进样量:10μL @ 40mg/mL

温度:室温

波长:UV @ 220nm

梯度:B在10分钟内从25%变成45%,然后在1分钟内从45%变成70%,70%B保持1分钟

图2.不同pH条件下的初步筛选结果

图3.不同pH洗脱液的优化梯度

图4.不同流动相的筛选结果

色谱柱:Luna 10μm-PREP C8(3) 100Å

规格:250x4.6mm

货号:00G-4623-E0

流动相:A: 如图所示;B: 100%乙睛

梯度:如图所示

流速:1.5mL/min

进样量:40μL @ 40mg/mL

温度:室温

波长:UV @ 220nm

色谱柱:Kinetex 5μm EVO C18

规格:150x4.6mm

货号:00F-4633-E0

流动相:A: 0.1%TFA水溶液;B: 100%乙睛

梯度:B在5分钟内从15%变成30%,然后在0.5分钟内从30%变成50%,50%B保持2分钟

流速:2.0mL/min

进样量:5μL

温度:室温

波长:UV @ 220nm

小试后用Kinetex EVO分析(图4)。可以看到一步纯化没有满足98.5%的纯度,并且期望的最终产品是醋酸盐,所以在二次精纯时需要使用醋酸盐优化。

结果和讨论

两步法纯化,纯度>98.5%原始原料的纯度估计为66%,使用Kinetex EVO作为分析柱(图5)。第一步进行了简单的上样量研究并在条件下确定了粗品1%上样量没有问题(图6)。收集第一步的主峰馏分收集,进行分析,纯度为96.5%。第二步切换醋酸盐,收集主峰,浓缩冻干,HPLC分析成品纯度为99.3%。

图5.Kinetex EVO分析初始粗品纯度

色谱柱:Luna 10μm-PREP C8(3) 100Å

规格:250x4.6mm

货号:00G-4623-E0

流动相:

A: 0.5%TFA水溶液

B: 乙腈

流速:1.5mL/min

温度:室温

波长:UV @ 220nm

梯度:

Time/min

B%0311036124113751475

色谱柱:Luna 10μm-PREP C8(3) 100Å

规格:250x4.6mm

货号:00G-4623-E0

流动相:

A: 0.5%乙酸铵水溶液(pH4.6)

B: 乙腈

流速:1.5mL/min

温度:室温

波长:UV @ 220nm

梯度:

Time/min

B%030154016801780

图6.艾塞那肽粗品的多级纯化工艺

当然小试成功,最终还需要考察上样量在最终批次上的优化,许多因素都会影响制备色谱柱的载量。

更多应用案例,

飞诺美MDS实验室小贴士:

01

肽的载量主要取决于具体样品的溶解性。

02

如果需要较高的分离度,应降低载量。

03

载量取决于上样条件,但小分子样品受此影响相对较小。

a) 肽上样一般在高水相条件下进行,通常会添加TFA。在这种条件下,体积载量几乎是无限的。载量受限于洗脱过程中的溶解性。

b) 干燥的肽可用DMF或DMSO等溶剂溶解。接下来通常使用TFA水溶液进行稀释。

c) 在某些情况下,会先将肽溶于DMF或DMSO,然后再注入上述溶液。

04

合理的进样体积由采用相对较强的溶剂时50mm柱长的色谱柱直径决定。增加柱长可兼容更大的进样体积,但二者并不成比例。使用较弱的溶剂时需要大幅增加进样体积。

05

需要根据色谱柱直径选择合理的流速。柱长越长、粒径越小,柱压就越大,系统受到的限制也就越大。部分用户倾向于采用比分离小分子时更慢的流速来分离肽,因此会采用推荐流速1/2的流速,同时将梯度持续时间翻倍。

飞诺美MDS实验室Xccelerator服务项目会根据您公司的要求,提供不同阶段的支持,从分析方法开发到制备纯化,加速您公司药物研发的进程。我们也非常乐意让我们的科学家到您的实验室帮助解决问题,或者提供现场培训、专项研讨会或技术咨询。

                                               

                                               

                       

                                               


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