药品中基因毒性杂质的痕量分析，非得用MS吗？

目前对于药品中含有的极少量物质（如基因毒性杂质等），在对其进行痕量分析时，通常采用的检测手段是：利用先进的液质联用（如LC-MS或LC-MS/MS等）、气质联用（如GC-MS或GC-MS/MS等）设备，对其微量物质进行检测时所需液相色谱系统可能为更高级的超高效液相色谱仪。

如检测药物中含有亚硝胺类基因毒性杂质NDMA，根据不同原料药的性质不同，目前国际上公布的方法主要有：GC-MS法、GC-MS/MS法、UPLC-APCI-MS/MS法，HPLC-UV法（EDQM公布）。国内官方公布的方法主要有GC-MS法、GC-MS/MS法、UPLC-APCI-MS/MS法，如中国药典2015年版二部推荐使用GC-MS法（详见《缬沙坦》原料中N-亚硝基二甲胺的含量测定方法），不推荐使用HPLC-UV法，因为HPLC-UV法灵敏度比质谱仪的灵敏度差很多，而且专属性差些，容易受到检测干扰，故HPLC-UV法具有很大的局限性，只能准确测定那些含量相对较高的物质。

然而现有检测技术中：

● 质谱仪价格昂贵，运行成本高，所需的试剂要求高，抗干扰能力差，维护保养费用很高，同时对质谱仪操作人员的水平要求非常高，需要高层次的人才方能准确操控。故质谱仪普及率非常低，一般企业较少购置，对于需要使用质谱仪进行痕量分析时只能委托特定的机构使用质谱仪进行检测。

● 气相色谱/质谱法操作过程繁琐，经过前处理后样品损失严重。

● 高效液相色谱仪价格便宜，操作容易，覆盖面广，一般企业均很常见。但是单纯使用HPLC-UV法进行检测含量极少的物质时，其灵敏度差，不能准确定量检测出复杂原料药中含量极低的物质，且检测过程中目标化合物所受干扰亦较大，目标化合物与其它杂峰之间的分离难度较大。

基于以上痕量检测的难点，没有质谱仪的帮助，实验人员是否可以通过长期大量的研究，不断尝试各项色谱条件的调试，诸如：流动相试剂的组成、梯度程序设置、柱温、流速的改变等。

特别是色谱柱的筛选，如虽然同样都是十八烷基硅烷键合色谱柱，可以尝试不同品牌、不同系列的C18柱，色谱柱间填料的差异会呈现出对样品的不同选择性。另外，色谱柱规格的差异也会带来不同的检测效果，如色谱柱的内径越细灵敏度越高、色谱柱越长柱效越高、填料的粒径越小分离效率越高……光是色谱柱就有多达7项以上的可调节参数。

最近就有一家药企尝试走了这样一条路，对尼扎替丁中所含痕量杂质N-亚硝基二甲胺（NDMA）检测方法进行了长期研究，最终探索出一种采用HPLC法测定样品中NDMA的方法，该方法简便快速，且测定结果准确。

这就是湖南威特制药股份有限公司。在他们的开发报告中记录到：

“我们首先尝试解决了色谱分离的问题，因供试品溶液浓度很大，其他峰对目标物质NDMA的干扰较多，在摸索优化检测方法的过程中，对色谱柱的选择做了大量的工作，既要不被干扰，又要保证峰形正常，且需能够增加该峰的检出能力，最后选择了特定的月旭Ultimate^® ODS-3  4.0×250mm，3μm色谱柱，且此型号的色谱柱批间差异较小。保证了该方法成功通过了方法学验证，并最终获得了发明专利授权。”

湖南威特测试了来自至少4个色谱柱厂家的十几种C18柱，最终月旭Ultimate^® ODS-3 4.0×250mm，3μm这款柱子展现了其独特的分离和检测特性，4.0mm内径具有更高的灵敏度，3μm粒径也提供了更高的柱效。在这款色谱柱的基础上，客户继续配合优化其他的色谱条件，最终确定了这个简便快捷，且测定结果准确的HPLC方法。

典型谱图

艰辛的付出，终于获得了回报。感谢湖南威特为我们示范了超高的液相方法开发水平，展示了不同色谱条件配合玩转色谱柱，为方法开发带来的无限可能！

参考文献：

一种HPLC法检测尼扎替丁中N-亚硝基二甲胺的方法

（专利号：ZL202110045224.4；授权公告日：2023.07.28）