从实验到数据分析，一文搞定“单细胞免疫组库”

2023-08-10 15:47:14

一. 免疫系统及免疫组库

免疫系统(immune system )是机体行使免疫功能的系统，由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成，分为固有免疫系统和适应性免疫系统，具有免疫防御、维持内稳态和免疫监视等功能。因此免疫系统在维持机体健康、抵御感染和机能恢复等方面扮演着非常关键的角色。

图一：人体免疫系统

揭示免疫系统功能机制能够为疾病治疗、癌症干预和药物研发等提供思路和线索，伴随着高通量组学技术的发展，尤其是近些年单细胞技术的迅速普及，除了常规的血清学等研究手段，单细胞技术在免疫系统的研究中也大放异彩。今天要和大家分享的就是单细胞测序技术在免疫研究中的应用：单细胞免疫组库。

免疫组库（Immune Repertoire，IR）是指在指定时间，某个体循环系统中所有功能的多样性T细胞和B细胞的总和。从骨髓的造血干细胞发育到胸腺中成熟T细胞和骨髓中成熟B细胞，此阶段中发生的V(D)J重排会导致IR的多样性。T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)是T细胞特异性识别和结合抗原肽MHC分子的分子结构，其功能为识别抗原。B细胞抗原受体(B cell receptor， BCR)是B细胞识别抗原的一种膜表面蛋白，具有抗原结合特异性。B细胞受抗原刺激后，会增殖分化出大量浆细胞。浆细胞可合成和分泌对应的免疫球蛋白（immunoglobulins，Igs）进行“体液免疫”。BCR与TCR结构有明显区别，其结构图如下：

图二：TCR/BCR结构示意图

如图所示，BCR由两条重链和两条轻链连接而成，其中重链分为可变区(V区)、恒定区(C区)、跨膜区及胞质区；轻链则只有V区和C区。TCR每条肽链可分为V区、C区、跨膜区和胞质区。TCR分为两类，多数T细胞的TCR由α和β链组成, 少数TCR由γ和δ肽链组成。BCR和TCR的V区有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3变异最大，直接决定了抗原结合特异性，对于B细胞和T细胞多样性的研究也就集中在CDR3 区。

图三：CDR3结构示意图

如图所示，BCR的CDR3区包括轻链V、J基因片段和重链V、D、J基因片段，TCR的CDR3区包括α链V、J基因片段和和β链V、D、J基因片段。依据CDR3氨基酸序列的差异对BCR或TCR进行分析，可以揭示其clonotype分型、V-J基因丰度分析和相关免疫解析。

免疫组库部分应用方向

捕捉肿瘤发生时免疫微环境的变化，筛选免疫治疗靶点，提高免疫治疗效果。
解析器官或者骨髓移植时宿主免疫排斥机制，提高器官移植成功率。
自身免疫性疾病机制研究和防治。
感染性疾病免疫动态监测、抗体开发、用药及疫苗效果评估等。

二. 实验流程

单细胞免疫组库实验主要基于10X Genomics平台“双十字”系统实现单细胞捕获，然后进行逆转录、V(D)J富集和文库构建。

图四：10X Genomics实验流程

细胞分选和建库流程

Step 1

GEMs形成和Barcode标记

V(D)J建库的barcode序列连接的是switch oligo TSO序列，mRNA先是通过ploy(T)引物反转录，反转录到mRNA 5’末端，在末端加上序列CCC, 与TSO的GGG序列互补配对，实现cDNA的抓取，继续转录从而在5`端cDNA序列加上barcode序列。

Step 2

V(D)J区域富集

用5''接头的通用引物和TCR恒定区的连续巢式引物进行巢式PCR，此过程加上测序接头P5，实现TCR/BCR的V(D)J区域富集。

Step 3

构建文库

酶消化的方式将V(D)J cDNA随机打断，通过控制打断不同长度而得到的序列，可以覆盖整个V(D)J片段cDNA序列，末端修复加A，再加上测序接头P7，PCR扩增建库。

图五：10X Genomics Gel Beads结构

图六：10X Genomics免疫组库建库流程

对质检合格的文库即可安排上机测序，针对免疫组库文库，每个细胞推荐PE150策略测序不少于5000条reads。

三. 免疫组库数据分析流程

单细胞V(D)J技术能够特异性富集T细胞TCR区域和B细胞BCR区域的RNA，通过比对、拼接、筛选、注释等对免疫组库数据进行构建，并对得到的TCR/BCR进行clonotype分型，进而进行免疫分析。

通过对免疫组库数据进行生物信息学分析，可以得到免疫组库的丰度和结构信息、免疫组库的组成多样性、VDJ高频突变等信息，能够帮助我们理解机体在特定条件下的免疫状态，为机制研究和疾病防治提供关键提示。

四. 文献案例

案例1：

早期肺腺癌浸润性免疫细胞单细胞分析揭示癌症早期免疫微环境复杂性

The Single-Cell Immunogenomic Landscape of B and Plasma Cells in Early-Stage Lung Adenocarcinoma

期刊：Cancer Discovery IF:28.2 时间：2022.11

肿瘤浸润性B细胞和浆细胞（TIBs）在肺腺癌（LUAD）中普遍存在，但对于他们的研究比较欠缺。本研究对16个早期LUAD和47个对应的多个区域正常组织同时进行单细胞RNA和B细胞受体（BCR）测序。通过对约50000个TIBs的综合分析，最终在LUAD和邻近正常生态系统中定义了12个TIB亚群，并证明了LUAD中TIB普遍具有重塑现象。主要结果包括：记忆B细胞和浆细胞（PC）在肿瘤组织中高度富集，分化程度更高，体细胞超突变频率增加。吸烟者表现出显著升高的PC，并具有明显的分化轨迹。LUAD患者、吸烟者的BCR克隆型多样性增加，但克隆性降低，且病理分期增加。TIBs主要定位于CXCL13+淋巴聚集体内，产生CXCL13的免疫细胞随着LUAD的进展而进化，同时CD4调节性T细胞的升高部分。本研究描绘了了早期LUAD中TIBs的空间景观。

案例2：

跨组织单细胞免疫组库分析揭示了人类的组织特异性

Cross-tissue immune cell analysis reveals tissue-specific features in humans

期刊：Science IF:56.9 时间：2022.5

尽管免疫细胞在健康和疾病中发挥着至关重要的作用，但我们对人体组织中的免疫细胞的认识仍然有限。本研究通过单细胞RNA测序和免疫组库VDJ测序对来自12名成年捐献者的16种组织的免疫细胞进行了分析，生成了一个包含360,000个细胞的数据集。同时为了系统解决组织间的免疫细胞异质性，本研究还开发了CellTypist：一种能够快速和精确的细胞类型注释的机器学习工具。基于开发的机器学习工具，结合条件筛选，最终确定了精细免疫细胞表型和不同种类在组织中的分布，揭示了目前还未获得足够重视的组织特异性特征和T细胞和B细胞的克隆结构。多组织研究方法为利用一个共同的参考数据集、组织整合表达分析和免疫组库测序来识别高分辨率的免疫细胞类型奠定了基础。