【生物制品宿残检测方案】让宿主细胞DNA残留无处遁逃

2024-04-15 11:15:14

近年来，随着技术的不断进步，越来越多的生物制品也参与到疾病的预防和治疗中，为人们的健康保驾护航。生物制品在生产过程中多以细胞为生产基质，可能导致宿主细胞DNA的残留。宿主残留的DNA可能存在多种潜在风险，包括但不限于免疫反应、毒性作用以及可能的基因转移等。因此，对生物制品中宿主细胞DNA的残留进行检测显得至关重要。与此同时，细胞治疗和基因治疗作为新兴的治疗方式，为肿瘤疾病及罕见病患者提供了更为有效的治疗选择，其中，宿主DNA残留检测也是必须的质控环节之一。

生物制品常见宿主细胞

按制备时使用的细胞类型不同，可分为原核宿主细胞和真核宿主细胞。

原核宿主细胞

大肠杆菌（E. Coli）是应用最广泛的原核细胞之一，细胞基因治疗中常利用大肠杆菌制备质粒DNA来构建病毒载体。大肠杆菌也可作为表达系统，用于表达分子量小或结构相对简单的蛋白。

真核宿主细胞

真核细胞常用作生物制品中疫苗的制作和病毒的扩繁，例如使用非洲绿色猴肾细胞（Vero）制备狂犬疫苗、新冠疫苗等；中国仓鼠卵巢细胞（CHO）和人胚胎肾细胞及其衍生细胞系 (HEK293) 因其有效地生产各种正确折叠重组糖蛋白的特性，常用作重组蛋白药物的生产，另外HEK293也常用作包装病毒的宿主细胞。

宿主残留DNA风险

生物制品（如重组蛋白药、抗体药、疫苗及基因治疗细胞治疗等产品）中宿主核酸残留会引起诸多风险：

感染性及致癌性风险

宿主细胞残留DNA感染性多归于可能携带的传染性病毒基因组，如HIV病毒，可作为染色体外组分或整合到人体基因组，扩增催生传染性病毒粒子，增加宿主细胞残留DNA的感染性风险。此外，宿主细胞残留DNA可携带显性致癌基因，可能会导致生物制品具有潜在致癌性。

免疫原性风险

生物制品中的宿主细胞残留DNA可能会激活模式识别受体，引起非特异性免疫反应。此外已有报道，高剂量的核酸样品（DNA疫苗或CpG寡脱氧核苷酸）诱发产生不良免疫反应。

宿主残留DNA的检测方式

宿主细胞DNA残留监测关系到生物制品质量及产品安全，检测定量产品中来源于生产细胞的DNA残留是生物制品安全性和质量控制的关键点。

各国药品监督管理机构对宿主DNA残留有明确规定，《欧洲药典》规定DNA残留不得超过10 ng/剂，美国食品药品监督管理局 (FDA) 规定DNA残余限度不得超过100 pg/剂量，对于大剂量的单抗药物可放宽至10 ng/剂量。《中国药典2020版》《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》等要求需对宿主细胞DNA的残留量进行检测，并保证检测结果在相应的规定范围内。如细胞基质宿主DNA残留量应≤100 pg/剂，细菌或真菌基质生产的疫苗，其宿主DNA残留量应≤10 ng/剂。

监管部门同样也给出相应的检测方法，国内《中国药典2020版》对外源DNA残留量测定推荐三种方法：DNA探针杂交法、荧光染色法和定量PCR法。其中定量PCR法具有序列特异性高、灵敏度高、重现性好，定量检测等优点，已经成为宿主细胞残留DNA检测的主流方法之一。

宿主残留DNA检测难点

目前定量PCR法中的探针法为宿主细胞残留DNA检测的主流方法之一，但提取检测仍存在一些难点：

宿主残留DNA丰度低，对样本提取要求严格，需保证对宿主细胞DNA进行有效提取。

待检样本数量多，手动提取不能满足实际需求。

样本背景较复杂，会对定量结果造成干扰。

提取检测时间久，效率低。

宿主残留提取检测方案

TIANGEN公司在核酸提取和纯化领域深耕多年，针对宿主残留DNA检测难点，自主研发生物制品宿主细胞残留DNA提取及检测试剂，助力宿主残留检测。

DNA提取

针对宿主残留DNA含量低，待检样本数量多的问题，开发磁珠法宿主残留DNA提取试剂盒（HD101），可配合手工或搭配TGuide S32 Pro全自动核酸提取纯化仪，保证质量的同时提高效率, 为方便客户使用，提取试剂盒为常温运输保存，提高便利性，防止组分丢失。

磁珠法宿主残留DNA提取试剂盒（HD101）

点击查看产品详情

▪ 操作灵活：磁珠法，可配合手工或TGuide S32 Pro全自动核酸提取纯化仪。

▪ 通用性强：可满足高低pH、高盐、高蛋白等复杂样品的核酸提取。

▪ 准确灵敏：加标回收率在70%-130%；可以纯化富集低至fg级别的DNA。

▪ 快速高效：操作步骤简单，1h即可完成整个流程。

加标回收率表现优异

图1：模拟样本提取结果及加标回收率

模拟样本计算得到的加标回收率均介于70%-130%之间，符合《中国药典》要求（50% - 150%）。

图2：HD101及市面2款宿主细胞DNA残留提取产品的实验结果对比

3款提取产品的加标回收率均满足《中国药典》的要求（50%-150%），HD101相比竞品，在2个标准品浓度下的加标回收率值更高，CV值更稳定。

残留DNA检测（探针qPCR法）

为应对背景噪音干扰，针对不同宿主，开发的试剂盒使用特异的探针，让定量结果更加准确灵敏。此外预稀释标准品设计，方便快捷开展宿主残留DNA的qPCR检测。

Vero残留DNA检测试剂盒（HD201）

CHO残留DNA检测试剂盒（HD202）

Human残留DNA检测试剂盒（HD203）

E.Coli 残留DNA定量试剂盒（HD204）

产品特点

▪ 准确灵敏：检测准确，重复性好, 选用国家标准品，试剂批间批内稳定。

▪ 专属性强：受其他物种干扰值低，无交叉反应。

▪ 耐用性强：DNA碎片化不影响检测结果, 仪器通用性强。

▪ 快速高效：预稀释标准品设计，方便快捷开展qPCR实验。

定量检测试剂盒通用于生物制品（原材料、中间品、半成品和成品）宿主DNA残留量检测。

检测线性范围宽广

4款检测试剂定量结果线性化好，范围宽广，扩增效率高。

图3: HD201(Vero)、HD202(CHO)、 HD203(Human)和HD204(E.Coli)对各自目标标准品的扩增曲线

宿主细胞DNA检测专属性强

4款检测试剂检测目标宿主细胞DNA的qPCR扩增曲线重叠性高，检测专属性强，抗外源物种基因组片段干扰能力强。

图4: 不同外源基因组干扰下HD201(Vero)、HD202(CHO)、 HD203(Human)和 HD204 (E.coli) 的qPCR扩增曲线

DNA片段碎片化检测结果准确

4款检测试剂的qPCR扩增曲线和标准曲线同对照相比，重叠性好，定量检测结果不受影响。

图5：HD201、HD202、HD203和HD204对片段化的Vero、CHO、Human和E.Coli DNA qPCR检测（扩增曲线）

参考文献

1.体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行），国家药品监督管理局药品审评中心，2022 。

2.国家药典委员会，中华人民共和国药典（2020年版）。

3.World Health Organization. (1987). Acceptability of cell substrates for production of biologicals: report of a WHO study group [meeting held in Geneva from 18 to 19 November 1986].

4.European Pharmacopoeia Commission. European pharmacopoeia 9. 8[M]. Strasbourg: European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare, 2019.

的近期文章