【揭秘】加速植物基因功能研究的关键指导要点

2023-08-10 15:47:14

植物基因功能的研究可以为作物重要农艺性状的人工选择、驯化和改良提供夯实的理论基础，具体的研究策略包括转基因实验、组织切片观察、时空表达模式分析、蛋白活性分析和分子调控通路解析等。

转基因功能验证

植物转基因技术是研究植物基因功能中最重要的一种手段，传统的研究策略是构建基因的过表达/knock-down（敲低）/knock-out（敲除）株系，或是通过突变体互补实验来验证目标基因的生物学功能。此外，目前基于CRISPR/Cas9技术还可以实现转基因植株knock-up(敲高)。

上下滑动查阅：

Nature Plants上的一项研究利用基因编辑技术，在无供体DNA条件下大幅提高了靶标基因的表达量，创制出了抗双唑草酮和氟草啶两种作用机理除草剂的非转基因水稻材料，实现目标基因Knock-up(敲高)株系的构建^[1]。

Nature Biotechnology上2023年报道了两篇来自于中科院遗传所高彩霞课题组关于植物基因编辑的前沿进展，研究人员通过植物细胞中建立的PrimeRoot系统，成功在水稻HPPD基因5’UTR区精准插入1.4 kb的Actin启动子，成功实现基因UTR区域的原位插入^[2]；研究人员利用碱基编辑和引导编辑系统创制出了OsTCP19, OsTB1和DLT基因的uORF突变体，成功实现对3个基因的梯度敲除^[3]。

根据自身研究的需求合理的选择适合的转基因实验策略，可以更好地为分子机理的解析以及实际应用服务。

实验小Tips

选择合理的方式鉴定转基因阳性植株，可以针对载体插入（基因组）-基因表达水平（mRNA）-蛋白表达水平（蛋白）进行递进式地鉴定。
避免假阳性结果，每种转基因构建至少鉴定到3个以上的独立株系；仔细分析植株基因型与表型之间是否存在紧密的关联性。
排除干扰，对于同源基因可以有选择性的进行突变鉴定，避免出现严重的脱靶效应；CRISPR编辑的株系可以进行回交实验，消除脱靶效应造成的基因组干扰。

时空表达模式分析

对于目标基因的功能研究首先可以通过探究基因（蛋白）的时空表达模式来理解其生物学功能，研究策略可分别从mRNA水平以及蛋白水平来进行探究。常用手段包括qPCR基因表达水平分析、RNA原位杂交、组织GUS染色、亚细胞定位、免疫组化荧光等。

几种常见基因（蛋白）时空表达实验展示

A. 水稻乙酰转移酶OsgIHAT1的qPCR表达谱

B. OsgIHAT1穗原基的RNA原位杂交结果

C. OsgIHAT1启动子驱动的GUS染色^[4]

D. TMK1顶端弯钩内外层细胞处的免疫荧光^[5]

实验小Tips

根据实验需求合理选择取材部位，同一部位取材时需要考虑营养生长和生殖生长的影响。
基因表达水平分析时，根据研究组织特异性需要选择合适的管家基因作为内参，必要时可以选择2种内参基因分别进行定量分析。
亚细胞定位实验可以选择瞬时转化材料（烟草叶片、原生质体）或稳定表达材料进行实验。

遗传材料的丰富性对于植物研究的推动作用意义重大，但是实际遗传材料的鉴定涉及到的工作量非常大。针对该问题，TIANGEN推出包含高通量样本前处理+RNA快速提取的“RNA快速解决方案”。

TGrinder H24R组织研磨低温均质仪

（OSE-TH-02）

无需液氮即可实现低温环境（-10℃）下

同时处理1-24个独立研磨管样品

RNA Easy Fast植物样本快速提取试剂盒

（DP452）

特别适合植物样本RNA的快速提取

● 兼容性强：适用于普通植物和多糖多酚植物样本

● 简便快捷：30 min之内快速完成RNA提取

● 安全低毒：不使用β-巯基乙醇、DTT、氯仿、酚等有毒试剂

RNA Easy Fast植物样本快速提取试剂盒(DP452)

提取4种植物果实RNA完整性良好

基因分子通路解析

基因调控性状的分子机制研究已经逐渐成为目前植物科学研究领域的主流研究内容，通常是对于蛋白-蛋白，蛋白-核酸之间分子调控关系的研究，从而系统解析植物性状调控的分子通路。

基因功能调控关系的深入探究，涉及到多种分子实验包括酵母单/双杂交、体外Pull-down、Co-IP、ChIP-qPCR、EMSA、转录激活/抑制等实验。基于原生质体转化的下游功能实验种类丰富，是植物蛋白功能研究的一种重要技术手段。高浓度低内毒素水平的质粒对于高质量的原生质体转化实验是必不可少的。

无内毒素质粒大提试剂盒（增强型）

（DP120-01）

适用于100-200 ml菌液体积的无内毒素质粒大提

● 高纯度：采用独特的内毒素沉淀技术，特异的去除内毒素

● 操作简便：采用吸附柱技术特异吸附质粒，操作更为简便

● 高效转染：适合包括内毒素敏感细胞在内的绝大多数细胞的转染

● 应用广泛：动植物细胞转染、分子生物学实验均可应用

重组蛋白的表达经常是限制蛋白实验成功开展与否的决定性因素，常见的重组蛋白表达主要是通过大肠杆菌原核表达系统来进行，经常容易出现的问题就是蛋白不表达或是蛋白不可溶的情况；此外，大肠杆菌系统对于很多膜蛋白、转录因子、二硫键含量丰富的蛋白表达效果并不理想。

CFS无细胞蛋白表达系列产品

TIANGEN无细胞蛋白表达系列产品，使用麦胚提取物在体外可以实现对核蛋白、膜蛋白、毒蛋白等多种蛋白的体外重组表达，操作步骤简单，实验周期相较于大肠杆菌系统可缩短至2天以内。

实验小Tips

基于IP-MS技术筛选得到的互作蛋白可能会存在很多间接互作的情况，需要进一步的体内外验证。
ChIP实验对于抗体特异性、目标蛋白的表达丰度要求较高。
体内实验尽可能选择稳定表达的遗传材料，其次选择瞬时表达的材料开展实验。

TIANGEN一直致力于推动中国生命科学领域的基础研究蓬勃发展，针对科研工作者的实验需求，推出了从DNA/RNA提取、反转录、荧光定量、分子克隆到蛋白表达的整体解决方案，方便科研工作者便捷、高效地完成相关实验。如需咨询或购买，可联系销售人员。

文献引用：

[1] Lu Y , Wang J , Chen B ,et al. A donor-DNA-free CRISPR/Cas-based approach to gene knock-up in rice. Nature Plants (2021). 7, 1445–1452.

[2] Sun C, Lei Y, Li B, et al. Precise integration of large DNA sequences in plant genomes using PrimeRoot editors. Nature Biotechnology (2023).

[3] Xue C, Qiu F, Wang Y, et al. Tuning plant phenotypes by precise, graded downregulation of gene expression. Nature Biotechnology (2023).

[4] XJ Song, T Kuroha, M Ayano, et al. Rare allele of a previously unidentified histone H4 acetyltransferase enhances grain weight, yield, and plant biomass in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2015),112(1):76.

[5] Cao M, Chen R, Li P, et al. TMK1-mediated auxin signalling regulates differential growth of the apical hook. Nature (2019), 568, 240–243.

的近期文章