一个提升蛋白表达效率的方法,90%的科研人都还不知道

2023-05-19 21:53:32


抗体的应用非常广泛,制备特异性抗体可用于检测、分析多种分子和细胞,为生物学研究提供有利支持。

 

传统抗体生产通常是通过免疫动物免疫以及后续的细胞融合、筛选等步骤来获得。这个过程需要几周甚至几个月的时间,实验成本较高(包括免疫动物的购买和饲养、免疫原的制备和购买等)。 

 

与传统方法相比,无细胞蛋白表达技术是一种细胞外的基因表达技术,通过含有蛋白合成所需各主要组分(如氨基酸、酶、各种因子等)的表达系统,不受细胞核(核酸DNA/RNA)、线粒体、细胞骨架等的干扰,在体外快速、大量表达蛋白,同时避免了复杂的细胞培养和纯化步骤。


Cell-Free System(CFS)

无细胞蛋白表达系统

CFS利用麦胚提取物,人工提供蛋白表达所需的酶、辅助因子,并模拟表达环境,仅使用PCR片段或载体为模板,即可在反应体系中通过双层液相反应法 (Bilayer Reaction Method) 进行蛋白表达。表达成功率高达95%,总蛋白产量高达4 mg/6 mL,绝大多数表达出的蛋白具有天然的结构和活性。

 

CFS操作简单,只需四步,构建好模板DNA后,两天即可获得目的蛋白。

与传统细胞内表达系统的区别

● 无需诱导培养,大大简化了操作步骤以及下游实验流程,能够用于高通量实验;

● 体外表达取消了生理限制,显著提高具有功能性、可溶性、全长蛋白的总体产量;

● 可实现磷酸化修饰,并不受蛋白毒性影响,十分适合激酶、膜蛋白等毒性蛋白的表达;

● 并可通过修饰的tRNA,在特定位点插入非天然氨基酸标记。


抗体Fab片段高稳定性表达系统

在制备抗体的过程中,研究抗体的Fab片段可以为制备抗体提供重要的指导和参考。无细胞蛋白表达技术在制备抗体Fab片段方面有许多优点。这项技术不仅能够提高抗体纯度,还能避免传统制备方法中细胞培养污染和稳定性差等问题,从而缩短制备时间,有效降低成本。

Fab片段中的二硫键是抗体正确折叠和稳定性的基础。在真核生物中,多肽的合成是在细胞质的还原环境中进行的,而二硫键是在内质网(ER)的氧化环境中形成。无细胞蛋白质表达系统中的蛋白质合成通常在还原性条件下进行为解决这一问题,CFS-EDX-DB试剂盒引入了参与真核生物二硫键形成的蛋白二硫键异构酶 (PDI) 和 ER 氧化还原酶 1α (Ero1α),为蛋白提供DTT-free的表达环境,以确保二硫键的稳定形成。

研发团队选择抗AGIA-IgG抗体(兔)的Fab片段作为测试蛋白,如下图所示,该蛋白除了三个重链(H)和三个轻链(L)中的二硫键之外,Fab片段还包含重链和轻链(H-L)之间的二硫键。此外,几个脯氨酸残基以顺式形式形成肽键。使用CFS-EDX-DB试剂盒表达了这个具有复杂结构的Fab片段,并通过Pull-down实验分析了它与AGIA抗原序列(EEAAGIARP)的结合能力。


IgG(兔)Rab 片段结构和二硫键位置


蛋白表达后功能验证

在四种不同的条件下(1: Empty, 2: + PDI and Ero1α, 3: + CypB, 4: + PDI, Ero1, and CypB)合成蛋白,通过Pull-down实验验证AGIA序列与每个Fab片段的结合亲和力。Western blotting结果验证,由PDI和Ero1α合成的Fab片段(GST-AGIA第2和第4道)确实与AGIA序列结合。



无细胞蛋白表达系统的广泛应用

CFS无细胞蛋白表达技术不仅能够用于抗体制备,还可用于重组蛋白及复杂蛋白的生产,如重组人胰岛素、酶、激素等。这些蛋白质的生产通常需要复杂的细胞培养体系,但在无细胞蛋白表达技术的帮助下,生产过程变得更加高效、简单。


在药物筛选领域,无细胞蛋白表达技术可用于多种蛋白的快速表达及筛选体系建立。帮助药物研发人员更快找到适合的药物,缩短药物研发时间和成本。

无细胞蛋白表达技术的出现,为蛋白功能的研究和药物研发带来了新的思路和方法。


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参考文献:

[1] yano, T. et al., AGIA Tag System Based on a High Affinity Rabbit Monoclonal Antibody against Human Dopamine Receptor D1 for Protein Analysis. PLoS One, 2016. 11(6): eD156716

[2] Bulleid, N.J., Disulfide bond formation in the mammalian endoplasmic reticulum. Cold Spring Harb Perspect Biol., 2012. 4: a013219

[3] Inaba, K. et al., Crystal structures of human Ero1α reveal the mechanisms of regulated and targeted oxidation of PDI. EMBO J., 2010. 29(19): 3330-3343


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