准确测定！SEC与MALS/HRMS联用表征治疗性单克隆抗体

2023-07-12 21:19:11, 张玲艾杰尔-飞诺美（Agela & Phenomenex）

介绍:

与尺寸较小的分子相比，分子量大小约为150KDa的治疗性单克隆抗体在通过尺寸排阻SEC色谱柱时的表现可能会与预期不同。当使用基于UV检测器的MW校准曲线时，这种差异会导致与预期分子量的偏差。其原因是由于这些大的治疗蛋白质在通过色谱路径时表现出的构象变化。与多角度光三散射检测器（SEC-MALS）联用的尺寸排阻法，可用于测定溶液中大分子的摩尔质量和分子量。该技术提供了分子量信息和单克隆抗体（mAb）及其聚集体的鉴定。相比之下，高分辨率质谱（HRMS）可提供这些抗体的准确质量信息。将这两种技术结合在一起可以为抗体表征领域提升显著优势。

SEC-MALS检测原理

多角度激光散射（Multi-Angle Light Scattering, MALS）是基于蛋白的分子量与光散射的强度直接相关来测定蛋白绝对分子量的技术。

其具有准确度高、无需使用标准蛋白、不依赖洗脱保留时间和直接准确测定蛋白绝对分子量的特点。

通过SEC分离后的各组分进入多角度光散射检测器，激光照射到分析物时会发生光的散射。

MALS通过多个角度同时测定散射光的强度，散射光强度正比于摩尔质量、浓度、折光指数增量的平方，从而直接计算出分析物的绝对分子量。

因此，在制药领域，SEC-MALS广泛应用于研发和分析实验，表征蛋白质和聚合物、评估溶液特性、工艺开发和质量控制等。

蛋白分子量检测

多聚体分子量检测

多糖分子量及分子量分布分析

核酸分子量检测

rAVV实心率和颗粒浓度分析

mRNA-LNP的颗粒分布分析

第二部分：材料和方法

试剂盒化学品

Vectibix^®（Panitumumab）和Enbrel（Etanercept）购自Myoderm（Norristown,PA）单克隆抗体和聚集体的回收/二聚体峰进行观察和定量。

SEC-MALS联用的HPLC条件：

优化的SEC-HPLC溶剂（50mm K₃PO4，200mm KCl，pH6.8）和优化的MS兼容溶剂（100mM乙酸铵, pH6.8）分别用于单克隆抗体的SEC-MALS和SEC-MS的表征。ACQUITY UPLC H-Class PLUS生物检测系统连接至Wyatt MALS/RI检测器。

HRMS条件：Agilent-1600安捷伦液相色谱系统与Sciex 7600 ZenoTOF进行SEC-MS联用。使用Sciex OS和Sciex Biologics Explorer进行质谱数据分析。SEC-MALS数据分析使用Wyatt的软件。

色谱柱和HPLC方法如下：

Column: Biozen 1.8μm dSEC-2,200Å

Dimensions: 300x4.6mm

Part No.: 00H-4787-E0

Mobile Phase:Described above

Flow Rate: 0.35mL/min

Column Temp.: Ambient

Sample: 1mg/mL; Injected 2uL

完整蛋白检测模式：

Scan Type: TOF MS

Spray Voltage: 5500

TOF Start Mass: 1000

TOF Stop Mass: 8500

Declustering Potential: 250

Collision Engerty (V) : 6

Instrument: Sciex 7600 ZenoTOF

Source: Turvo V lon Source with Resistor Tubing PN: AJ1-23A1

结果：

图1：在Biozen dSEC柱上的表征：帕尼单抗的MALS曲线显示二聚体和单体主峰的分离度

表1. 帕尼单抗单体和聚集体的USP分辨率和MW信息

图2：帕尼单抗的总离子流图(左)&放大版(右)显示了聚集体和片段

图3：帕尼单抗单体(RT7.035-7.606)在非变性条件和精确质量数下的质谱图

结果：

图4：使用生物惰性(Bio-Ti)色谱柱的依那西普的UV曲线，显示分离度增加

图5：依那西普的TIC图（左）和谱图（右）由于其糖基化异质性无法通过HRMS进行分析，显示出复杂的光谱图

图6：biozen-dSEC（Bio-Ti惰性）色谱柱上依那西普MALS检测显示的单体和聚集体之间的分辨率

讨论：

在SEC分析中，使用MALS检测器或HRMS分析mAb治疗药物。正如预期的那样，发现MS和MALS数据之间存在差异，MS提供了准确的质量信息。当使用完善的USP条件时，MALS色谱图类似于传统的SEC-UV结果。并且比使用MS条件时产生更高的USP分辨率值。对于这些高盐浓度，使用Phenomenex的BIO-TI柱硬件,可以获得更好的聚集体/二聚体分子量分析和定量/回收率。

在这种情况下，高盐浓度含量抑制抗体和SEC固定相之间的相互作用，从而导致更高的二聚体和单体峰的峰分辨率。此外，聚集体和单体的分辨率降低时，使用通用的非生物惰性SEC柱硬件，从而导致RS值较低和聚集物种（四聚体）较高。

结论

SEC-MALS分析抗体可以用于定量和得到较高的回收率。然而，只有SEC-MS能提供用于表征的准确质量。如果SEC色谱柱硬件具有生物惰性表面，可以得到更高的分辨率用于单体和聚集体的分离。这些结果表明，适当调节流动相可以优化SEC-mAb的相互作用，结合SEC-MALS和SEC-MS检测的特点我们可以更加充分表征治疗性抗体。