项目文章 | 单细胞测序揭示新城疫病毒在鸡体内外的单细胞图谱

Result1 NDV的单细胞图谱

感染高毒力Herts/33、低毒力LaSota菌株的鸡肺组织6个样本，先通过磁珠分选免疫（CD45+）和非免疫细胞（CD45-），及体外强毒Herts/33感染鸡胚成纤维细胞系DF-1的两个样品，并进行单细胞转录组测序。共得到以下几种细胞类型：T细胞，单核巨噬细胞-中性粒细胞，上皮细胞，成纤维细胞和内皮细胞。与此同时，作者提供了用于细胞鉴定的标记marker（后续客户做相同样本类型可以参考marker基因）。从每个样本的细胞类型的分布，可以看出NDV感染后每种细胞类型的比例发生了变化。其中，成纤维细胞和单核巨噬细胞-中性粒细胞的比例增加，特别是Herts/33和LaSota株感染后单核巨噬细胞-中性粒细胞的比例显著增加。Herts/33株感染后，上皮细胞、内皮细胞和T细胞的比例下降。LaSota株感染后上皮细胞比例增加，内皮细胞和T细胞比例下降。在体外，细胞类型变化趋势也是如此。

图1 NDV感染后鸡肺部的单细胞图谱

Result2 基质细胞的表型异质性

作者通过免疫荧光测定进一步证实了肺部成纤维\\上皮\\内皮细胞的存在。分别对成纤维\\上皮\\内皮细胞进行亚型分析。

其中，将成纤维细胞分成了6个cluster（图2B）。通过GSVA分析，对每个cluster进行了功能描述，结果显示：成纤维细胞与病毒，IFN或炎症反应通路相关（图2D）。为了进一步了解NDV感染后，成纤维细胞是如何分化的，作者通过Monocle2拟时序分析来推断细胞的伪时间轨迹。拟时序结果发现，体内\\体外的成纤维细胞存在不同的分化方向，体内成纤维细胞由cluster2、3、4向cluster3、4、6分化，体外成纤维细胞由cluster2、3、4向cluster1、5分化（图2F）。为了进一步揭示体内\\体外感染过程中不同调节模块的基因表达，对三种特异性的模块进行了GO富集分析（图2G）。结果显示，module1大多数基因参与IFN反应和调节的生物学过程；module2基因主要参与宿主中病毒转录，宿主中病毒基因组复制和病毒生命周期；module3基因主要参与病毒基因组复制、宿主细胞释放病毒等。作者筛选了成纤维细胞轨迹过程中变化最大的基因，通过基因动力趋势图展现基因在不同状态下不同的表达趋势（图2H）。结果表明，体内\\体外部分基因表达在伪时间内存在差异，成纤维中的IFN响应在体内逐渐增强，在体外下降（图2I）。

作者针对上皮细胞、内皮细胞同时也都做了亚型分析、GSVA分析、拟时序分析及可视化等等（具体结果见原文）。结果发现，在内皮细胞中，高毒力NDV Herts/33菌株或非毒力LaSota菌株的感染可在内皮细胞中引起抗病毒反应，表现出不同的IFN响应。在上皮细胞中，NDV感染不会激发上皮细胞中的IFN响应。

图2 成纤维细胞的异质性

Result3髓系细胞的表型异质性

作者通过免疫荧光测定进一步证实了肺部髓系细胞的存在（图3A）通过对髓系细胞亚型分析，发现体内\\体外的髓系细胞的5个亚型数量发生变化（图3B、E）。同样，这五个亚型主要富集在病毒、IFN响应或者炎症反应通路（图3D）。针对巨噬细胞、单核细胞做拟时序分析，结果发现， LaSota 感染组是由state2向state1分化；Herts/33 感染组是由state2向state3分化（图3F）。在分化过程中，module1所含基因主要参与病毒反应的生物学过程、对病毒的防御反应、调节细胞凋亡；module2所含基因主要参与对病毒的防御反应、先天免疫应答、炎症反应；module3基因参与线条免疫应答、IL-1介导的信号通路等。进一步在单核巨噬细胞的在分化过程中的IFN响应通路，结果显示，IFN响应在state1、state3显著增加（图3I）。因此，高毒力NDV Herts/33菌株感染或非毒力LaSota菌株感染均可在单核巨噬细胞中引起显著的IFN反应。

图3 髓系细胞的异质性

Result4 T细胞的表型异质性

获得了1655个T细胞，包括1585个体内的T细胞和70个体外的T细胞，它们被分成10个不同的簇，通过GSVA来检查每个cluster的功能。Cluster的功能集中在病毒，IFN和炎症反应上（图4D）。拟时序结果显示，体内NDV感染状态的T细胞具有两个分化方向，一个方向由高毒性的Herts/33菌株主导，另一个方向由非毒性的LaSota菌株主导（图4F）。为了进一步探索NDV感染后的宿主反应，在T细胞的拟时序轨迹中研究了IFN反应。IFN响应在两种状态下显示出不同的模式（图4H），LaSota感染后的IFN反应比Herts/33感染后强得多。因此，这可能是低毒力的LaSota株可以作为疫苗使用的原因。

图4 T细胞的异质性

Result5 NDV RNA在所有细胞类型中的表达

在五种主要细胞类型中的每种细胞类型中，毒性Herts/33菌株在感染细胞中普遍存在，但在两个成纤维细胞中仅检测到非毒性LaSota菌株的M基因表达（图5A-C）。每种主要细胞类型中每种病毒结构基因片段的分布和表达如图5 D-F所示。接下来，作者利用了感染细胞和旁观者细胞之间的宿主基因表达变化。由于ISG通常与病毒RNA传感有关，因此检查了ISG在这些细胞中的表达（图5I）。针对病毒阳性和病毒阴性细胞做差异基因富集分析，发现大多数基因功能在对病毒的防御反应，先天免疫应答和炎症反应中富集，并参与自噬，细胞凋亡和Jak-STAT通路（图5J、K）。

图5 有高毒力NDV Herts/33菌株RNA的细胞类型

（展示部分结果）

Result6 所有细胞类型间的细胞通讯分析

对照组、高毒力NDV Herts/33菌株和非毒力LaSota菌株组之间的受体和配体之间的特异性相互作用显示出不同的模式。尽管对照和非毒力LaSota菌株组之间的特定相互作用模式显示出略微相似的场景（图6G）。在对照组中，胶原蛋白-整合素复合物相互作用对（COL4A2/α1β1、COL3A1/α1β1、COL14A1/α1β1或COL12A1/α1β1）最为突出。

图6 细胞间通讯

参考文献

Liu W, Xu Z, Qiu Y, Qiu X, Tan L, Song C, Sun Y, Liao Y, Liu X, Ding C. Single-Cell Transcriptome Atlas of Newcastle Disease Virus in Chickens Both In Vitro and In Vivo. Microbiol Spectr. 2023 Jun 15;11(3):e0512122. 

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排版人：七七

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