项目文章 | 单细胞转录组揭示含铂新辅助治疗抗药性的基因特征

Result 1 单细胞分析新辅助治疗前后肿瘤细胞差异表达基因

首先分别选取顺铂新辅助化疗的LUAD和ESCC患者新辅助化疗前后的肿瘤细胞，并进行差异分析。获得LUAD和ESCC新辅助治疗前后肿瘤细胞中共同表达差异基因485个。GO富集分析显示，主要富集在细胞粘附分子结合、酶抑制剂活性、钙粘蛋白结合等方面。KEGG富集结果表明主要富集在代谢物、退行性变化、癌变等方面。

图1 顺铂新辅助化疗前后肿瘤细胞的差异分析

Result 2 新辅助化疗差异基因和顺铂耐药相关基因的联合分析

在作者之前的研究中，对顺铂耐药和敏感细胞系进行了多组学分析，获得了相关的差异基因集。作者将这些差异基因集与获得的485个差异基因相交，得到64个与新辅助化疗疗效相关的关键基因，其中12个基因在LUAD、ESCC新辅助化疗前后和顺铂耐药细胞系中表达趋势一致。

图2 新辅助化疗差异基因和顺铂耐药相关基因的联合分析

Result 3 新辅助化疗评分(NCS)在单细胞数据中验证及CCLE数据库验证

作者将作为新辅助化疗评分构建的12个基因重新引入到LUAD和ESCC患者新辅助治疗前后的单细胞测序数据以及CCLE数据库中，结果发现LUAD和ESCC患者新辅助治疗前肿瘤细胞的NCS明显高于新辅助治疗后肿瘤细胞。在CCLE数据库中，低IC50组（顺铂敏感组）的NCS高于高IC50组。

图3 新辅助化疗评分(NCS)在单细胞数据中验证及CCLE数据库验证

Result 4 12个基因和NCS 在LUAD和ESCC单细胞数据中的应用

对LUAD患者的肿瘤细胞检测上述12个基因的表达情况，不难发现CAV2、PHLDA1、VDAC3在肿瘤细胞中普遍呈高表达。AddModuleScore函数构建NCS，12个基因在整个LUAD、ESCC及相应的癌旁组织样本中不同细胞的表达情况，结果显示NCS在肿瘤组织中的表达明显高于正常组织。作者将肿瘤细胞按NCS平均值分为2组，进一步观察其差异。

图4 12个基因和NCS 在LUAD和ESCC单细胞数据中的应用

Result 5 NCS分组肿瘤细胞差异表达基因分析

对LUAD两组进行差异分析，共获得796个差异表达基因(p < 0.001)，其中119个存在显著的fold change (|logFC|> 0.5)。这119个基因中有77个在低NCS组中显著上调，包括VDAC3、CAV3、PHLDA1、CD9等；42个基因均显著下调，包括LRRK2、SPINK13、TANC2等。GO富集分析显示，主要富集在钙粘蛋白结合、肌动蛋白结合、肽酶调节活性、内肽酶抑制活性等方面。KEGG信号通路主要富集在流体剪切应力和动脉粥样硬化、癌症中的蛋白聚糖和转录失调等方面。GSVA分析发现，硒氨基酸代谢、无义介导的mRNA降解、核糖体等在高NCS组中显著上调；ATF2靶点、对氧化磷脂的反应和对甲氨蝶呤的反应均显著下调。

ESCC中得到1676个差异基因，其中65个显著上调，14个显著下调。GO富集分析显示受体配体活性、细胞外基质等富集。细胞因子受体互作、病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体相互作用、IL-17信号通路等富集。GSVA分析发现，高NCS组中肿瘤微环境、上皮细胞、Barrett’s esophagus、食管癌相关通路显著上调，而TP73和TP63靶点、对金属离子的反应、对THC的反应显著下调。

对两组差异基因交集的表达数据进行LASSO回归分析。选取使整个模型均方差最小的22个特征变量：CD24、D9、DUSP23、KRT19、LRRK2、MAL2、PERP、SPINT2、TACSTD2、PHLDA1、C8orf4、CAV2、CAPN8、MDK、SLC20A1、SPINK13、TANC2、CLDN3、RGMB、S100P、VDAC3、C19orf33构建预测模型。最终得到17个indicators构建模型预测NCS。

图5 NCS分组肿瘤细胞差异表达基因分析

Result 6 有化疗记录的LUAD患者12个基因生存分析

基于TCGA和GEO数据集，首先对有化疗记录的LUAD患者的每个基因进行了K-M生存分析。CAV2、PHLDA1、ALCAM、CD9、IGBP3和VDAC3基因与预后显著相关(p < 0.05)。除ALCAM外，其他5个基因高表达的患者预后较差。CAV2、PHLDA1和VDAC3与预后的相关性最为显著。

在TCGA数据库中使用这12个基因对LUAD患者进行聚类分析，这些基因可以清楚地将患者分为两个亚型。这两种亚型之间存在显著的生存差异，因此初步推断，在LUAD中通过这12个基因的表达，可以得到含铂辅助化疗不敏感亚型，提示该亚型患者可能无法从新辅助或辅助化疗中获益。

单因素分析显示ALCAM、CAV2、VDAC3、PHLDA1、DUSP23和SPATS2L是LUAD患者预后的显著预测因子，多因素Cox比例风险分析显示ALCAM、CAV2、CD9、VDAC3、PHLDA1是LUAD患者生存的独立预后因素。得出5个独立危险因素(ALCAM、CAV2、CD9、VDAC3、PHLDA1)。CAV2、VDAC3和PHLDA1表达较低的LUAD患者预测生存时间较长。

图6 有化疗记录的LUAD患者12个基因生存分析

Result 7 TCGA数据库中进一步验证

除肺腺癌，作者还在TCGA数据库中选择了标准新辅助治疗中含有顺铂且有化疗记录的2种癌症：胃腺癌和头颈部鳞状癌。对先前获得的基因进行LASSO回归分析，初步筛选可能与新辅助患者生存相关的基因，然后建立相应的logistic回归模型。然后分别对模型进行验证，首先对KM生存曲线的分布进行验证，发现模型划分数据集的两组之间存在显著的生存差异；其次，绘制了不同时间风险模型的ROC曲线和AUC，三种模型在1年、3年和5年的AUC均大于0.6，显然，AUC值越高，表明模型的预测能力越强。

Result 8 在A549、PC9和TE1细胞中PHLDA1、CAV2、VDAC3的表达与顺铂敏感性相关

作者在体外实验水平上验证与预后最相关的三个基因是否与顺铂耐药相关。选择2个LUAD细胞系A549和PC9以及1个ESCC细胞系TE1进行实验。细胞在敲除PHLDA1、CAV2和VDAC3基因后对顺铂的敏感性增加。

图7 分别沉默CAV2、PHLDA1和VDAC3可显著增加对顺铂的敏感性

END

排版人：七七

原创声明：本文由欧易生物(OEBIOTECH)学术团队报道，本文著作权归文章作者所有。欢迎个人转发及分享，未经作者的允许禁止转载。