项目文章 | 单细胞转录组分析揭示了亚硝酸盐胁迫对对虾血细胞的毒性机制

Result1 亚硝酸盐胁迫对对虾血细胞形态学影响

亚硝酸盐胁迫下，对虾总血细胞计数(THC)随时间显著降低，12h时相对于对照组降低74.3%。FACS显示对虾血细胞有三个血细胞亚群，即颗粒细胞(GC)、半颗粒细胞(SGC)和透明细胞(HC)。亚硝酸盐胁迫会改变三种亚群的比例。其中，透明细胞比例从9.74% (Con)增加到47.5%（12 h）。然而，颗粒细胞和半颗粒细胞呈相反的趋势，颗粒细胞比例从45.3% (Con)到27.5% (12 h)，半颗粒细胞比例从37.2% (Con)下降到21.4% (6 h)。作者推测透明细胞比例的增加是由于海洋甲壳类动物颗粒和半颗粒细胞数量相对减少所致。

图1. 亚硝酸盐对血细胞亚群的影响

Result2 scRNA-seq揭示亚硝酸盐胁迫对血细胞亚群的影响

为了进一步了解对虾血细胞的异质性反应，本研究使用scRNA-seq分析亚硝酸盐胁迫后的血细胞转录组。总共获得24334个细胞进行了测序（对照组Con11,394, 实验组Nit12,940）。使用的聚类算法SNN，最终确定了9个cluster(cluster1-9)，其中Con组有37-3634个细胞，Nit组有38-1894个细胞，这9个cluster包含186-1213个marker基因，热图结果显示，每个cluster的top10marker基因几乎完全分离。接着作者分别使用Lectin标记cluster3,4,7为透明细胞、proPO标记cluster2为颗粒细胞、26个高表达基因标记cluster1,5,6,8为半颗粒细胞。

为了评估亚硝酸盐胁迫是否影响细胞聚集，在亚硝酸盐处理后检测细胞聚集。单细胞结果显示，无论是Con还是Nit组都没有特异性的集群，这表明亚硝酸盐胁迫对细胞集群的影响很小。此外，细胞分化轨迹也没有明显变化。接着作者对不同细胞进行差异分析，结果显示亚硝酸盐胁迫下共鉴定出394个基因(|log2FC|≥0.585,p值≤0.05)，其中透明细胞、半颗粒细胞和颗粒细胞的上调基因分别为19、81和45个，下调基因为79、55和115。

图2. scRNA-seq揭示亚硝酸盐胁迫对血细胞亚群的影响

Result3亚硝酸盐胁迫后三种细胞亚群的相互作用

为了解对虾血细胞中亚硝酸盐反应的机制，作者鉴定了每类血细胞亚群中的DEG。首先作者将血细胞群体作为一个整体，鉴定出243个DEG，包括GAPDH、HSP70、HSP90、IL-16、EF-2和PRLAR2基因，与以往的研究相似。大多数DEG是细胞亚群特异性的（上调:54；下调:78）；KEGG结果显示，共同的DEG主要富集于“mitochondrial genome maintenance”和“glutamine gamma glutamyltransferase activity”等通路，可能是亚硝酸盐胁迫的标志，这些通路的基因包括IL-16，GAPDH，TYMP，SLC2A1，SLC28A，TGM2等基因。值得注意的是，亚硝酸盐应激导致代谢相关基因表达减少，而炎症因子相关基因表达增加，支持了先前亚硝酸盐应激导致高水平的研究，接着作者使用qPCR和ELISA分别检测IL-16mRNA表达量和GAPDH酶活，结果显示亚硝酸盐胁迫使IL-16mRNA表达量显著上调，12h时达到最高，为对照组的13.6倍；相比之下，GAPDH酶活性显著下调，并在12 h时达到最低，这与scRNA-seq数据一致。

KEGG富集分析表明，每种细胞类型对亚硝酸盐都有特定的反应，为了解细胞间的异质性，作者对3类细胞分别进行了分析。

图3. scRNA-seq分析揭示了亚硝酸盐胁迫下血细胞亚群的不同反应

Result4 亚硝酸盐胁迫下半颗粒细胞（SGC）的异质性响应

拟时序分析结果表明，对照组样品的SGC位于轨迹的开始，亚硝酸盐胁迫组样品位于轨迹的末尾，表明对虾对亚硝酸盐胁迫的响应可能取决于SGC的变化。差异基因结果显示，SGC在实验组中上调的基因主要富集在脂肪代谢、吞噬和环境信息处理等通路，这表明SGC不仅作为炎症反应的介质，也是满足亚硝酸盐应激下对虾基本代谢需求的能量来源。有趣的是，甘油磷脂代谢中间化合物1- o-烷基甘油-3-磷酸(AGP)是醚类脂质的前体，可能是炎症和过氧化物酶体促进铁死亡的关键因素；SGC在实验组中下调的基因主要富集在糖酵解和氨基酸代谢相关的KEGG通路，表明亚硝酸盐胁迫下代谢通路显著失调。

因此，作者提出亚硝酸盐在SGC中毒性作用的主要机制如下：1、谷胱甘肽不仅是一种抗氧化剂，也是解毒途径的组成部分，在SGC中，表达谷胱甘肽合成限制酶谷胱甘肽合成酶(GS)的细胞数量在亚硝酸盐胁迫后显著减少，提示谷胱甘肽代谢受到限制；2、GSH- px可以催化H2O2和有机氢过氧化物还原为水和相应的醇，将GSH转化为GSSG，将有毒的过氧化物还原为无毒的羟基化合物，从而保护细胞器的结构和功能免受氧自由基的损伤。因此，亚硝酸盐胁迫可能通过降低GSH-Px的活性来促进ROS的生成；3、亚硝酸盐胁迫下对虾的免疫系统和抗氧化相关酶受到抑制，导致氧化应激的发生和对虾对病原体的易感性增加。

图4. 半颗粒对亚硝酸盐胁迫的异质性

Result5 亚硝酸盐胁迫下颗粒细胞（GC）的异质性响应

GC差异基因主要富集在抗氧化系统、酚氧化酶原(proPO)，类酚氧化酶3 (PO)，类过氧化物还毒素2A (PRXL2A)和酚氧化酶活化因子2样(PPAF，GPX)，精氨酸和脯氨酸代谢(如谷氨酰胺合成酶样(GS)和精氨酸激酶(AK))，抗菌肽系统(如penaeidin-2b)，因此，GC亚群主要提供体液免疫防御，并维持虾的基本代谢需求。此外，差异基因分析显示，在亚硝酸盐胁迫下，GC亚群中有55个上调基因和81个下调基因。值得注意的是，GC亚群中表达的上调基因主要与丝氨酸型内肽酶相关，如PO、PPAF2和PPAF3，虽然PO在三个亚群中均有表达，但主要在GC中表达，这表明酚氧化酶原激活刺激了免疫应答的其他重要过程。在生长方面，GC亚群中EF-2和IGFBP2表达上调，可能促进了保护蛋白的合成，增强了对虾对亚硝酸盐胁迫的抵抗力。总之，该研究数据表明，亚硝酸盐胁迫导致精氨酸代谢失调和ROS清除不平衡，这可能是其毒性机制之一。

图5. 亚硝酸盐胁迫下颗粒细胞的异质性

Result6亚硝酸盐胁迫对对虾的毒性机制

在水中亚硝酸盐暴露后，作者发现血细胞中的亚硝酸盐浓度升高，而周围外部水中的浓度降低。说明亚硝酸盐容易在虾体内积累。与水环境相比，血细胞中较高的亚硝酸盐浓度可能部分解释了亚硝酸盐对虾的明显毒性。有研究表明，血细胞中亚硝酸盐的积累可诱导ROS过量产生，导致氧化应激；而过量的ROS会扰乱细胞稳态，导致蛋白质和细胞成分氧化损伤，诱导DNA损伤和细胞凋亡；细胞已经进化出抗氧化酶和非酶抗氧化系统来对抗ROS，如GSH-Px、谷胱甘肽和自噬。本研究数据显示，亚硝酸盐处理后HC无显著差异。然而，作者观察到总血细胞以及SGC和GC亚群中ROS的产生显著增加，这表明SGC和GC对亚硝酸盐高度敏感。研究结果显示，自噬体在总血细胞中以及SGC和GC亚群中有显著的积累，这意味着ROS可以启动自噬体的形成。

作者通过FACS分选和RT-qPCR检测关键基因的表达水平证实了这一结果。数据表明，亚硝酸盐胁迫抑制抗氧化酶系统是其毒性的机制之一。炎性因子(IL-16和nfil3)和GSH-Px在总血细胞中的表达降低，特别是在GC和SGC亚群中，进一步支持了本研究的scRNA-seq数据。之前研究结果表明，虾的防御主要依赖于血细胞的活性，为了进一步证实亚硝酸盐胁迫对虾免疫力有负面影响，作者通过RNA干扰沉默了penaeidin基因（一类小分子可以直接抑制或杀死病原菌）。结果表明，亚硝酸盐胁迫后溶藻弧菌侵入虾血细胞系统的速度与对虾素表达沉默时的速度相似，这些结果表明亚硝酸盐会破坏虾的免疫力。

图6. 亚硝酸盐胁迫对对虾的毒性机制

图7 亚硝酸盐胁迫对对虾影响的概略图

【参考文献】

Liang Q, Dong B, Li A, Wu L, Zhang Y, Han T, Liu X. scRNA-seq analysis reveals toxicity mechanisms in shrimp hemocytes subjected to nitrite stress. Chemosphere. 2023 Mar;316:137853. doi: 10.1016/j.chemosphere.2023.137853. Epub 2023 Jan 11.

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排版人：七七

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