项目文章 | J HEPATOL （IF：25.7）同济大学杨长青教授团队多组学联合分析揭示乙酰氨基酚诱导肝损伤机制

2023-07-11 16:09:57, 质谱创新组学上海欧易生物医学科技有限公司

研究背景

对乙酰氨基酚（APAP）是是一种广泛使用的非处方药，但在过量使用或长期使用时，可能导致严重的药物性肝脏损伤（DILI），甚至引发急性肝衰竭（ALF）。Mas是一种G蛋白偶联受体，它在多个生理过程中发挥重要作用，包括抗炎反应、细胞凋亡和自噬等。然而，关于Mas在乙酰氨基酚引起的肝损伤中的作用还知之甚少。

前言

2023年5月31日，同济大学附属同济医院杨长青教授团队在Journal Of Hepatology期刊（IF 25.7）发表题为“Hepatocyte-specific Mas activation enhances lipophagy and fatty acid oxidation to protect against acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice”的研究成果。文章通过转录组测序、蛋白组学、代谢组学、脂质组学等方法，来评估药物性肝损伤小鼠的肝脏损伤、脂质代谢和自噬过程。研究表明肝细胞特异性的Mas激活可以作为一种潜在的治疗策略，用于保护肝脏免受APAP等药物引起的肝损伤。欧易生物为该研究提供了提供转录组测序，鹿明生物为该研究提供了蛋白质组学和代谢组学技术支持。

研究思路

研究材料

研究材料：

1）人的肝组织；

2）小鼠肝组织；

3）小鼠细胞系（AML12、L02）；

研究技术：

1）蛋白组学：ITRAQ；

2）转录组学；

3）代谢组学：LC-MS；

4）脂质组学；

5）代谢通量分析；

研究结果

1. 在人和小鼠DILI中，肝内Mas表达上调

免疫组化（IHC）结果显示，与健康对照组相比，DILI患者肝内Mas显著上调（图1A）。此外，多重免疫组织化学（mIHC）显示Mas在实质细胞（肝细胞）和非实质细胞中广泛表达，包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肝星状细胞和内皮细胞（图1B）。不同剂量APAP攻毒后，小鼠肝内Mas蛋白（图1C）和mRNA （图1D）表达均显著上调。Mas的广泛表达模式在多个小鼠组织和细胞类型（图1E）中得到证实。此外，在人和小鼠肝细胞系中，APAP刺激后Mas mRNA的表达显著上调。总之，这些发现表明Mas可能参与DILI。

图1 Mas在人和小鼠药物诱导的肝毒性中的肝内表达

2. 全身性Mas1缺乏加剧APAP诱导的小鼠肝毒性

为了探索Mas在体内的作用，比较了用APAP（300mg/kg，24h）治疗的Mas1^-/-和野生型（WT）小鼠的疾病表型。有趣的是，Mas1^-/-小鼠对APAP表现出极大的不耐受性（图2B）。当受到致命剂量的APAP挑战时，Mas1^-/-小鼠的存活率很低（图2C）。在喂养状态下，Mas1^-/-小鼠也观察到类似的对APAP的不耐受。免疫印迹（WB）显示，在Mas1^-/-APAP小鼠肝脏中，炎症（IL-1β）、线粒体应激（p-JNK）和细胞死亡（cleaved-caspase3，Bax）的标记物的蛋白表达水平明显升高（图2D）。在转录组学中，KEGG富集分析显示，在Mas1^-/-小鼠的肝脏中细胞凋亡、坏死、铁萎缩和炎症通路富集的基因表达显著升高（图2E）。随后探索坏死在APAP诱导的肝脏毒性中的关键作用，结果发现Mas没有参与APAP的代谢过程。在APAP过量的情况下，数字自适应光学扫描光场互迭代断层成像（DAOSLIMIT）分析显示广泛的坏死导致无菌性炎症（SI）和炎症细胞增加（图2F）。

图2全身Mas1缺失会加剧APAP诱导的小鼠肝脏毒性

3. 全身性Mas1缺失损害APAP诱导小鼠脂肪自噬和FAO

转录组学、蛋白组学和代谢组学被用来探索APAP过量时的肝内Mas信号通路，差异表达的mRNA和蛋白对（图3A）、mRNAs（图3B）和代谢物的KEGG分析主要富集到自噬（FOXO，PI3K-Akt）和脂肪酸降解（PPAR，过氧化物酶体）途径（图3C）。热图（KEGG，转录组学）显示，Mas1-/--APAP组与WT-APAP组相比，脂肪酸发生降解、自噬途径的下调、脂滴途径的上调（图3D）。在APAP过量的情况下，系统性Mas1缺乏推测可能会通过AKT-FOXO1轴损害自噬和脂肪酸降解。为了验证这一假设，作者进行WB、免疫荧光和靶向脂质组等分析，确定Mas1^-/-小鼠对APAP挑战的不耐受可能源于脂肪自噬和FAO的不足，可能受到AKT和FOXO1信号途径的调节。

图3在APAP诱导的小鼠肝毒性中

全身性Mas1缺失损害脂噬和FAO

4. 预防性激活Mas通过增强脂噬和FAO减轻APAP诱导的小鼠肝毒性

接下来，作者使用Mas激活剂AVE0991对Mas进行研究，结果显示AVE0991的预给药对APAP过量具有保护作用，并显著提高了WT-APAP小鼠的存活率（图4A-C）。进一步的分析显示，AVE0991降低了肝内炎症、细胞死亡和线粒体应激，而对肝脏浸润中性粒细胞有负面影响（图4D，E）。

研究还发现，AVE0991通过上调自噬和脂肪自噬来拯救脂解和脂肪酸氧化途径，并降低了AKT的活性，增强了FOXO1的信号传导（图4F-H）。转录组和代谢组学分析支持了这些结果，并发现AVE0991给药可增加单酰基甘油和磷脂酰乙醇胺水平（图4I-J）。应用靶向脂质组学定量肝内TAG，DAG，FFA和PE含量（图4K，L），共同证实了前期的推测。综上所述，Mas的预防性激活可以保护小鼠免受APAP过量的损害。

图4Mas的预防性激活诱导脂肪自噬和

FAO改善APAP诱导的小鼠肝毒性

5. 在APAP诱导的小鼠肝毒性中，脂噬和FAO是Mas预防性调节下游的关键参与者

为了确定自噬和FAO在APAP刺激后Mas信号通路中的作用，作者通过体内给予雷帕霉素（RAPA,经典的自噬诱导剂）、氯喹（CQ、自噬拮抗剂）、非诺贝特（PPARα激动剂）和Lanifibranor（泛PPAR激动剂），证明了自噬和FAO在WT-APAP小鼠中的有益作用。接下来，作者通过实验证明RAPA、非诺贝特和lanifibranor的给药显著缓解了APAP诱导的肝毒性（图5A、B）。此外，依托莫西（FAO的拮抗剂）的预先给药显著加剧了WT-APAP+AVE0991小鼠的肝损伤。在Mas1^-/--APAP小鼠中，RAPA给药显著增强了肝内脂噬、FAO和标志蛋白的表达（图5C），并增加了TEM下的AV数量（图5D），导致TGs （图5B）和LDs（图5E）减少。有趣的是，在Mas1^-/--APAP小鼠中，非诺贝特或lanifibranor给药诱导的脂肪分解和FAO（图5F）大幅增强，同时伴随着房室数量的显著增加（图5D），这表明自噬和FAO途径之间的相互依赖。随后又证明了，在Mas信号通路中，脂噬作用通过生成脂肪酸作为底物来增强下游FAO，同时自噬作用在FAO的上游起到调节作用（图5）。

图5脂肪自噬和FAO是预防调节Mas在

APAP诱导的小鼠肝毒性下游的关键参与者

6. AKT和FOXO1参与APAP诱导的小鼠肝脏毒性中Mas的下游预防调控工作

在这项研究中，作者发现FOXO1和PI3K-AKT是Mas1^-/--APAP和WT-APAP小鼠中显著差异表达的信号通路。此外，Mas1^-/--APAP小鼠的AKT增强，FOXO1被抑制，而WT-AP+AVE0991小鼠则呈现相反趋势。使用perifosine（p-AKT的抑制剂）、AS1842856（FOXO1的抑制剂）和sirtinol（去乙酰化酶的抑制剂）来确定AKT和FOXO1的作用，并主要通过所述标记物的mRNA和蛋白表达来评估肝内自噬、脂肪分解和FAO的过程。结果证明，在APAP刺激后，Mas可能通过负调控AKT和FOXO1信号通路来调节脂肪自噬和FAO（图6）。

图6 AKT和FOXO1参与了Mas在APAP诱导的

小鼠肝毒性中的预防性调节下游

7. 肝内和肝细胞Mas1缺失加剧了APAP诱导的小鼠肝毒性

接下来，作者使用携带短发夹（sh）Mas1的腺相关病和肝细胞特异性Mas1基因敲除（AlbcreMas1f/f）小鼠，确定肝内和肝细胞Mas在APAP过量中的作用。结果发现，WT-shMas1（图7A-E）和AlbcreMas1f/f（图7F-I）小鼠都表现出对APAP挑战的严重不耐受，这体现在肝脏毒性加重，同时伴随着肝内mRNA和蛋白的表达，表明自噬、脂肪分解和FAO受到损害。与之一致的是，在WT-Sh-Mas1-AP和AlbcreMas1f/f-AP小鼠中也发现了激活的AKT和抑制的FOXO1信号通路。除了ac-FOXO1的蛋白水平外，FOXO1的激活还通过其从细胞质的核转位来评估。

图7 肝内和肝细胞Mas缺失加剧了

APAP诱导的小鼠肝毒性

8. 肝内和肝细胞Mas1缺失加剧了APAP诱导的小鼠肝毒性

考虑到治疗性给药在APAP过量时的临床意义，作者探索了AVE0991在APAP激发后的不同时间点给药处理。在APAP处理后2 h，AVE0991对APAP过量仍然具有保护作用，表现为WT-APAP小鼠的疾病表型（图7J）和存活率（图S9C）显著改善。与此一致的是，AVE0991给药显著恢复了这些小鼠受损的自噬和脂肪酸降解（脂噬、脂解和FAO），如WB和荧光共染（图7K，L）所示。然而，在APAP处理后24-48 h，AVE0991给药未能对WT-APAP小鼠表现出保护作用。正如mIHC结果显示，AVE0991（APAP处理后24 h）对肝脏修复的影响不显著，与炎症浸润、血管生成和细胞增殖无关。

9. Mas通过AKT和FOXO1依赖性途径调节APAP刺激人和小鼠肝细胞中的脂自噬和FAO

作者利用siAkt（图8A-I）和siFoxo1（图8J-P）体外敲低小鼠肝细胞Mas通路中基因表达，来确定AKT和FOXO1的作用。使用RFP-GFP-LC3报告基因，通过点状形成来评估自噬内流，代表自噬体（黄色）和自噬溶酶体（红色）（图8B、C、K）。根据图8E所示的线粒体FAO步骤，FAO活性也可通过脂肪酸周转（图8F、G、M、N）、脂肪酸贩运到线粒体（图8H、O）和氧消耗率（图8I、P）进行评价。在从Mas1-/-小鼠获得的初级肝细胞中，siAkt明显诱导了标记物的蛋白表达，表明在APAP挑战期间FOXO1信号通路激活（图8A）。同时，siAkt明显增加了自噬的涌入、嗜脂和FAO的活动。相反，在WT小鼠初级肝细胞中，siFoxo1的施用大大减少了APE0991在APAP刺激期间诱导的脂质自噬和FAO的增强（图8J-P）。在L02（人肝细胞系）中也证明了AKT-FOXO1依赖的脂质自噬和Mas信号中的FAO（图8Q-V）。综上，在APAP刺激下，Mas的激活通过抑制AKT信号通路和激活FOXO1信号通路，增强了肝细胞的脂质自噬和FAO。

图8 Mas通过AKT和FOXO1依赖的途径调节APAP刺激的

人和小鼠肝细胞中的脂质自噬和FAO

研究结论

本项研究证实转录组、蛋白组、代谢组、脂质组学可以结合起来用于探索药物损伤机制。在人类和小鼠DILI模型中，肝内Mas表达明显上调。全身、肝脏特异性或肝细胞特异性Mas1缺乏的小鼠易受APAP诱导的肝脏毒性影响。他们表现出严重受损的脂质自噬和下游FAO，并伴随着AKT的激活和FOXO1的抑制。Mas的预防性激活对小鼠的APAP挑战有很强的保护作用，明显增强了嗜脂作用和依赖于AKT-FOXO1轴的FAO。此外，AVE0991的保护作用因抑制脂质自噬或FAO而大大减弱。

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综上所述，本研究使用转录组、蛋白组、代谢组联用，解决具体科学问题的文章。上海欧易生物提供了转录组测序，上海鹿明生物提供了蛋白组和代谢组技术，并得到了作者的致谢。蛋白组学、代谢组学以及转录组测序等多组学联用的方式可以为肝细胞特异性的Mas激活，保护肝脏免受APAP等药物引起的肝损伤的潜在治疗策略提供了新方式和思路。

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参考文献

10.1016/j.jhep.2022.10.028

文末看点｜lumingbio

上海鹿明生物科技有限公司是欧易生物旗下从事蛋白质组及代谢组质谱检测的专业质谱组学服务公司。公司建有国内第一个空间代谢组商业服务平台，深耕质谱组学检测分析，具体包括空间代谢组、双平台代谢组、靶向代谢组、TMT标记定量蛋白组、翻译后修饰蛋白组、4D-DIA蛋白组、单细胞及超微量蛋白组、空间蛋白组等。创新质谱组学平台广泛应用于机制解析、分型诊断、标志物筛选、药靶发掘等多个领域。公司并先后获得高新技术企业、上海市专精特新企业并建有院士专家工作站，自有包括tims tof pro2在内的各类大型质谱近二十台套，年服务项目超2000项。鹿明生物协助合作伙伴发表SCI论文近千篇，成功打造以硬数据、好服务为基础，以空间代谢组为特色的质谱组学检测服务公司品牌。