质谱的糖蛋白表征方法

通过质谱表征蛋白质的结构变异或修饰时，完整分子的质量测量可以呈现出整个蛋白质的一般特征，但不能提供变异或修饰的位置。换句话说，完整分子的质量测量并不能提供任何结构分辨信息。为了获得结构分辨的信息，需要在进行质量分析之前将蛋白质切割成较小的片段。这种切割过程可以在溶液中或气相中进行。当片段主要在溶液中生成时，质谱仪用于分析每个片段，分子根据从这些片段获得的信息构建：我们称这种方法为“up”类型方法。另一方面，当片段主要在质谱仪内的气相中生成时，质谱仪用于直接分析整个分子，我们称这种方法为“down”类型方法。

基于质谱的糖蛋白表征方法主要包括三个水平，即top-down、middle-up、bottom-up（肽段和糖碎片离子）。Bottom-up是最常用的结构表征方法，因为它能够同时完成蛋白序列及氨基酸残基上的糖基化位点解析。

BOTTOM-UP的结构表征

要确认蛋白质序列或在残基水平上表征修饰，最常用的技术是bottom up的方法。在bottom up的方法中，蛋白质被蛋白酶消化成小肽，然后进行LC/MS，或更常见的LC/MS/MS分析。蛋白水解与LC/MS/MS分析相结合，提供了高结构分辨率，但在质谱分析中，它通常是最耗材料、耗时且劳动密集的。消化过程中的假阳性，包括易失修饰如琥珀酰亚胺的丢失，以及氨基酸重排，可能导致错误的结论，因此需谨慎处理。bottom up广泛用于确认蛋白质序列，表征翻译后、过程中和贮存中的修饰，以及表征二硫键连接。

A.蛋白水解 通常在变性条件下对mAb进行还原和烷基化后，使用胰蛋白酶或Lys-C进行蛋白水解。其他不太常用的蛋白酶包括Glu-C（V8）和Asp-N。化学切割方法，如氰酸溴（CNBr）消化，也偶尔会使用。

以上所有方法通常将蛋白质切割成适当大小的肽，这些肽在MS/MS实验中能有效地片段。需要注意的是，在大多数商用仪器上，大肽（>4 kDa）很难通过MS/MS表征，而非常小的肽（2-3个残基）通常由于在反相柱上的保留不佳而丢失。

B. LC/MS 和 LC/MS/MS 在早期，MALDI-TOF仪器广泛用于测定从mAb和其他蛋白质的蛋白水解产生的肽的质量，用于结构确认和异构体/修饰分析。与ESI-MS相比，MALDI-TOF具有易用性，且耗材和时间较少的优点。然而，由于LC串联的便利性和肽鉴定所需的串联质谱质量较好，目前大多数在mAb上进行的自下而上实验都是在ESI仪器上进行的。

在LC/MS/MS肽图实验中，困难通常出现在mAb的蛋白水解上。通常需要大量的蛋白质材料才能获得成功的消化。只要实现完全消化，由于现代仪器的显著进步，MS检测的灵敏度通常不是问题。因此，大多数LC/MS/MS肽图实验是在小孔径RP-UPLC柱上进行，以获得最佳的色谱分辨率。

C.二硫键确定 要确定蛋白质内的二硫键连接方式，必须在二硫键仍然完整的情况下进行消化。在普通条件下，单克隆抗体分子非常稳定并且难以消化，因此单克隆抗体内的二硫键连接方式的表征具有挑战性。成功的消化关键在于在强性变性条件下使单克隆抗体变性，例如6M盐酸胍和高温。重要的是，在变性过程中必须存在烷基化试剂，如碘乙酸（IAA），碘乙酰胺（IAM）或N-乙基马来酰亚胺（NEM），阻止单克隆抗体中所有存在的自由巯基组来防止二硫键杂化。由于其在较低pH下的活性，通常优先使用NEM。消化前必须稀释变性剂以保留蛋白酶的活性。消化通常使用胰蛋白酶或Lys-C。随后，一部分样品会将使用DTT或者TCEP进一步还原二硫键，并将LC / MS / MS肽图与未还原图进行比较以确定二硫键连接。靠近铰链区域的二硫键通常使用Edman测序或者使用TCEP在弱酸性下在NEM or M-biotin存在的条件下部分还原检测。

另一个用于确定mAb中二硫键的有用方法是在负离子模式下通过LC/MS分析非还原消化物。在负离子模式下，二硫键通常被有效地断裂，以显示通过二硫键连接的链。这种方法可以被视为在气相中的二硫键还原。

Middle-UP的结构表征

虽然测定完整mAbs的质量可以给出蛋白质的整体表示，但它不能提供任何结构分辨率。要获得结构分辨信息，必须在质量分析之前将蛋白质切割成更小的片段。另一种方法，称为“Middle up”方法，包括在质谱分析之前将蛋白质（mAbs）切割成几个大片段。将mAb切割成几个大片段的一种方便方法是还原二硫键以生成重链和轻链。对单个链的质量分析可用于确认每个链的结构，或者定位每个单独链中的变体或修饰。

完全还原所有二硫键可以在变性条件下进行还原。在没有变性剂的情况下，可以选择性地还原链间二硫键，使链内二硫键保持完整。这种简单的还原方法已被用于确认mAb结构，表征抗体结构，确定轻链和重链上的不同修饰，并检查重链上的糖基化结构。

另一种常见的中间向上方法是在天然条件下用蛋白酶（如木瓜蛋白酶，胃蛋白酶）对mAbs进行处理。对于许多IgG类分子，这些有限消化的切割位点通常在铰链区附近，生成Fab、F(ab)2和Fc片段。然而，IgG2分子在天然条件下抵抗酶解。这些通过酶生成的片段还原后会产生更小的片段。这些片段的质量分析提供了比完整mAb质量测量更详细的结构信息。与还原方法类似，有限消化方法已被用于确认mAb结构，识别翻译后或化学修饰，以及表征抗体结构。

TOP-DOWN结构表征 

尽管bottom up的方法提供了最多的结构信息，但是它们需要大量的人力，而且常常存在一些问题，比如需要消耗大量样品，消化过程中可能会引入人为因素，以及样品制备需要花费很长时间。对于数量或浓度有限的样品，例如从色谱分离中获得的微量组分，需要进行多次收集和浓缩才能获得足够的材料进行成功的酶解。在这种情况下，top-down和middle-down成为提供有用序列信息的非常快速和方便的选择。

Top-down质谱法是指将完整分子引入质谱仪，而不进行溶液中的酶解或化学分解，并通过分析分子在质谱仪内的裂解模式来获得结构信息。自上而下的质谱法可成功地快速表征小到中等大小的蛋白质。由于产生的高度带电的碎片离子数量庞大，因此通常需要高分辨质谱仪进行top-down的质谱分析。通常来说，可以通过仪器分辨率来确定可用自上而下质谱法分析的蛋白质大小。例如，分辨率为10,000的Q-TOF型仪器应该可以为重量达到10,000 Da的蛋白质提供大量的结构信息。对于更大的蛋白质，首选具有更高分辨率的仪器，如傅里叶变换离子回旋共振质谱（FT-ICR MS）或Orbitrap。

MIDDLE-DOWN结构表征 

Middle down可能是解决自top down中结构分辨率有限问题的一种有价值的替代方法。在middle down中，蛋白质首先通过还原二硫键或者有限的蛋白酶水解作为中间步骤分成几个大片段，然后再被引入质谱仪进行MS/MS分析。与top down相比，middle down可以在一些有限的样品制备情况下潜在地提高结构分辨率。由于中等质量实验中所采用的还原二硫键是化学反应，可以使用大量的化学试剂来实现，因此它不像酶反应那样有样品浓度的要求，因为酶反应通常不使用大量的酶（贵贵贵贵啊）。因此，对于稀释的少量样品，middle down实验比top down更有优势。