客户案例 | IF31 RCT试验:定植母亲阴道菌群对剖宫产婴儿神经发育和代谢组的影响

该研究在严格筛查后招募了68对剖宫产母婴，随机分为剖宫产阴道菌群种植组（VMT）和剖宫产对照组（Con）。在剖宫产婴儿出生后1-2分钟内用母亲阴道液体纱布/无菌生理盐水纱布涂抹婴儿全身（盲法对照），采集其出生后42天内的粪便标本及安全性资料。研究期间进行安全性观察，包括不良事件（AEs）和严重不良事件（SAEs）。两组在出生后42天内不良事件的发生率相似（p > 0.999）。最常见的不良事件是轻度的皮肤疾病。这些不良事件性质轻微，婴儿在短期内可恢复。没有给任何有不良事件的婴儿使用抗生素或抗病毒药物，也没有因不良事件而退出实验。与Con组相比，VMT并未增加不良事件的风险。

图1. 三盲随机对照试验技术路线及研究主要结果

通过"Ages and Stages Questionnaire"（ASQ-3）问卷调查评分，问卷包括五个方面：沟通、粗糙运动、精细运动、问题解决和个人社交技能，得分之和代表整体的神经发育。VMT组3个月时的ASQ-3总分明显高于Con组，VMT组6个月时的ASQ-3总分增加了10.09%，显著高于Con组。这些结果表明VMT组的婴儿神经发育显著优于对照组。

图2. CON组和VMT组婴儿3个月和6个月的神经发育评分

对母亲的阴道拭子进行16S rRNA基因测序表明，乳酸菌在参与试验的女性生殖道中占主导地位。通过对婴儿粪便的16S rRNA基因测序，检测其肠道菌群在出生后3、7、30和42天的情况。使用SourceTracker软件评估婴儿肠道微生物组中来自母亲阴道液的成分比例。与对照组相比，VMT组的婴儿肠道微生物组在30天和42天具有更高比例的母源阴道细菌，表明VMT向婴儿提供了更多来自母亲阴道液的微生物组。无论是VMT组还是对照组的婴儿肠道菌群在3至42天之间都呈逐渐变化的趋势，如主坐标分析（PCoA）所示，从图中的左半部分向右半部分移动，表明符合预期的成熟轨迹（图3A，附图S4A和S4B）。通过使用无监督聚类算法，将婴儿肠道菌群分为两个组（S4C-S4F），也对应了在PCoA图中观察到的成熟轨迹，接下来测试了肠道微生物组成熟的速度是否与婴儿6个月时的神经发育相关。计算了每个婴儿在后期阶段（第42天和第30天的PCoA1均值）与早期阶段（第7天和第3天的PCoA1均值）之间的差异值，以代表其个体微生物组成熟的速度。VMT组显示出比对照组更快的成熟速度（p = 0.022，图S5A）。线性回归分析结果显示更快的成熟速度与更高的ASQ-3得分显著相关（p = 0.008，图S5B）。在调整了孕周、出生体重和婴儿性别后，结果仍具有统计学意义（p = 0.007）。这些结果表明VMT组加速婴儿肠道菌群成熟，使其与阴道分娩的婴儿相似。

图3. CON组和VMT组婴儿肠道微生物群的动态变化

图4. CON组和VMT组婴儿肠道主要微生物区系的变化轨迹

本研究使用靶向代谢组学对婴儿粪便中的300种代谢物进行绝对定量。共检测到288种代谢物在至少10%的样本中存在，并纳入后续分析(图S6)。代谢物的数量差异较大，亚油酸（平均213.97 mmol/g）、L-半胱氨酸（平均125.78 mmol/g）和乙酸（平均91.22 mmol/g）是主要的粪便代谢物。通过Procrustes分析检验发现婴儿肠道菌群和代谢组存在显著的协变关系，但效应大小较轻微（M2 = 0.779，p = 0.001，999次置换检验）。M2值在出生后的第3天到第42天逐渐降低，表明肠道菌群和代谢组之间的协变关系随着时间的推移变得更强。计算了VMT组和对照组剖宫产婴儿的代谢组Bray-Curtis距离与阴道分娩组（VD组）婴儿的代谢组之间的距离。最初VMT组的代谢组与VD组相比并没有显著更相似的特征，而对照组则相对较近。然而到了第42天，VMT组的肠道代谢组有一定趋向于与VD组的代谢组聚类，见图S6GH。

图S6. 各组各时间点肠道代谢物组成及代谢物组比较

阴道菌群种植可以增加15种肠道代谢物水平（图5A）。其中包括多种碳水化合物、氨基酸、熊去氧胆酸、L-乳酸、肌肽、羟基苯乳酸、香草酸、乙酸和吲哚乳酸。其中L-乳酸的显著性最高（p < 0.001，FDR = 0.024），与VMT组中观察到的乳杆菌水平高于对照组相一致（图4C）。此外，KEGG数据库的代谢通路分析显示阴道菌群种植上调22条代谢通路水平，如碳水化合物代谢、能量代谢、氨基酸代谢信号转导（HIF-1信号通路和cAMP信号通路）（图5B）。67种粪便代谢物与肠道微生物成熟度显著相关，主要分为氨基酸、胆汁酸、有机酸、脂肪酸和肉碱。其中，γ-氨基丁酸（GABA）与肠道微生物成熟度呈最高正相关，而L-肉碱与之呈最高负相关。这些结果表明，VMT对调节某些粪便代谢物和代谢功能水平具有影响。42天时L-肉碱水平与6个月时的ASQ-3总分呈显著负相关（p = 0.034）。即使在性别、出生体重、孕周和喂养方式等因素进行调整后，这种关联仍然显著（p = 0.025）。而GABA水平与神经发育评分没有显著相关。

图5. VMT组和CON组肠道微生物代谢组的改变以及与婴儿神经发育的相关性

通过代谢网络发现了125个差异代谢物，它们连接了神经发育评分、差异微生物分类和差异代谢物（图5C）。其中有15个是负相关，包括克雷伯氏菌和酒石酸。其余大多数相关是正相关，显示着微生物和代谢物之间的相互促进。当将肠道微生物和代谢物与神经发育联系起来时，除了克雷伯氏菌外，其他都呈现出正相关。所有与神经发育评分呈正相关的分类与代谢物在VMT组中上调，而唯一与之呈负相关的克雷伯氏菌则被下调（图4E），表明VMT可能通过调节特定肠道微生物属和代谢物来影响神经发育。

本研究表明，剖宫产阴道菌群种植组婴儿3-6月龄的神经发育总分显著高于剖宫产对照组；重新捕捉了剖宫产婴儿肠道微生物的成熟轨迹，发现VMT可以加速这一过程。这些发现提示对剖宫产婴儿中实施VMT具有潜在的神经保护作用，并使其表型更接近于顺产婴儿。此外，阴道菌群种植可以增加15种肠道代谢物水平（乳酸、高香草酸、吲哚乳酸等），并上调22条代谢通路水平（碳水化合物代谢、能量代谢、氨基酸代谢等）。在本研究中阴道菌群种植并未增加剖宫产婴儿的不良事件发生率。

该研究给出了初步临床证据，发现本次干预对剖宫产婴儿安全，且可能通过修复婴儿肠道菌群发育来改善其神经功能。同时需指出该研究局限性：首先，将新生儿暴露于母体阴道液可能不仅移植了阴道微生物群，而且也移植了阴道代谢物、真菌群、病毒组和其他物质，使得介导阴道微生物群移植功效的确切成分和机制不够清楚。需要建立一种更明确的移植母体阴道液的方法。其次，本文只研究了婴儿出生后42天内的肠道微生物群和代谢组，以及出生后半年内的神经发育。需要更大的样本量来检查个性化的近期和远期反应。

客户案例原文

Effects of vaginal microbiota transfer on the neurodevelopment and microbiome of cesarean-born infants: A blinded randomized controlled trial. Cell Host & Microbe. 2023.

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