高质量LNP综述！程强/魏妥发文详述mRNA-LNP技术在癌症治疗中的应用

随着COVID-19 mRNA疫苗（如Comirnaty、Spikevax和石药集团SYS6006）的成功上市，脂质纳米颗粒（LNP）已被证明是最安全、最有效的载体，能够帮助mRNA进入人体靶细胞。这种先进的技术不仅有助于实现快速研发和生产疫苗，而且在其他领域，如基因治疗和癌症治疗中也有广泛的应用。对于有志于了解最新医学技术的读者来说，了解LNP是如何改变我们对疾病治疗的认识，无疑是一件非常有趣的事情。

mRNA用于癌症治疗，也随着Moderna在研的新抗原疫苗mRNA-4157与默沙东Pembrolizumab的联合疗法获得美国FDA“突破性疗法”认定，而成为了新冠疫苗后mRNA疗法的下一个重要战场。

近日，来自北京大学的程强（星锐医药科学创始人）课题组与中科院动物所魏妥（星锐医药科学顾问）在期刊Advanced Materials上发表了题为“Lipid Nanoparticle (LNP) Enables mRNA Delivery for Cancer Therapy（LNP递送mRNA 用于癌症治疗）”的长篇综述文章。该综述总结了LNP-mRNA配方的主要发展策略，讨论了目前具有代表性的mRNA癌症治疗方法，并指出了该研究领域当前面临的挑战和可能的未来方向。

LNP-mRNA的制备过程

通常来说，LNP由4种组分构成，包含1)可电离阳离子脂质、2)磷脂、3)胆固醇和4)聚乙二醇(PEG)脂质。每种成分均在决定LNP的稳定性、转染效率和安全性方面起着至关重要的作用。

图1. LNP组分代表性结构

LNP-mRNA的包封制备：需要将乙醇-脂质混合物与含有mRNA分子的酸性水缓冲液（pH 4~5）按1:3的比例，通过微流控装置进行混合，实现自组装。组装过程中，可电离阳离子脂质首先被质子化并带正电荷，通过静电吸附作用与带负电荷的mRNA结合。同时，其它辅助脂质包括磷脂、胆固醇、PEG脂质在这之上进一步组装，形成稳定的LNP-mRNA。随后，通过缓冲液交换将mRNA-LNP溶液透析到PBS缓冲液(pH 7.4)中，去除未包封的mRNA、多余的脂质和乙醇，并调整到中性pH，使可电离脂质不带电，在生理pH下更加稳定且毒性更小。

LNP的主要开发策略，包括1)新型脂质分子的设计和筛选；2)LNP组分配方优化；3)LNP表面修饰；4)给药途径的选择。

新型脂质分子的设计与筛选

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可电离阳离子脂质

可电离阳离子脂质是LNP配方中的关键成分，其酸解离常数（pKa）决定了LNP的电离行为和表面电荷，并进一步影响LNP的稳定性和毒性。

传统的永久电荷阳离子脂质如DOTAP（溴化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基铵）在早前用于核酸递送的研究中，被发现极易与体内带负电荷的血清蛋白发生凝聚，将导致LNP被单核吞噬细胞系统快速清除，严重缩短了LNP的体内半衰期。且该凝聚作用增加了毒副作用的风险，导致红细胞膜破损和溶血。

由此，pKa值为6.0~7.0的可电离阳离子脂质应运而生。可电离脂质LNP（iLNP）确保了核酸在酸性条件下包封(pH 4.0，脂质被质子化)，并降低了体内循环过程中的毒性(pH 7.4，脂质变为中性)。LNP进入内涵体/溶酶体(pH低于表观pKa)后，LNP可以再次带正电荷，促进内涵体逃逸，将搭载药物释放到细胞质中。研究发现，LNP的pKa值在6.2-6.5和6.6-6.9时分别利于体内肝递送siRNA和肌肉注射mRNA疫苗。

可电离阳离子脂质结构可分为三部分：胺基头部基团（Headgroups）、疏水性尾部基团（Tails）和内部连接片段（Linkers）。

图2.可电离阳离子脂质结构

根据头部基团的胺基数量，阳离子脂质又可以分为单胺基或多胺基脂质。最著名的DLin-MC3-DMA(MC3)、SM-102和ALC-0315均是单胺基脂质，也是FDA批准的唯三可用于RNA递送的可电离阳离子脂质。然而这三种可电离阳离子脂质都不可经生物降解，在体内蓄积将产生潜在的细胞毒性。

研究人员通常专注于脂质尾部结构的调整，通过改变尾巴数量、设计线性或分支结构以及引入不饱和或可生物降解键来增强效力或赋予特定功能。例如，MC3的不饱和尾部促进了siRNA的内涵体逃逸，L319的酯键可加速细胞内脂质的降解。

在体或体外的高通量筛选(HTS)是获得优质候选脂质的常用手段，大多数文中提及的优质脂质都源于HTS。其中肝脏靶向LNPs的筛选是目前最易实现的。有研究表明，血液中大量的载脂蛋白E(ApoE)可以被吸附到常规LNPs的表面，从而通过ApoE-LDLR(低密度脂蛋白受体)的相互作用促进其肝细胞进入。

5A2-SC8就是基于HTS获得的一例具有代表性的肝靶向脂质，该脂质是由器官选择性靶向(SORT)技术奠基人Daniel Siegwart团队发现的。他们的早期研究表明，5A2-SC8 LNP可以在体内高效递送let-7g肿瘤抑制性miRNA，显著抑制原位肝癌的生长，延长小鼠生存期(图3A)[2]。

HTS也同样为肝外靶向递送脂质筛选提供了可能。Robert Langer与Daniel Anderson等人就以此设计了一种脂质聚合物7C1，有效将RNA递送到包括肺和骨髓等多个器官在内的内皮细胞（图3B）。该团队还设计了一类OF-Deg-Lin LNP，可在脾脏中有效产生蛋白(>85%)，并在体内实现B淋巴细胞的有效靶向(~7%)，显示了该配方载体具有调节B细胞功能的潜力(图3C)。

近期还有多种新型可电离脂质被高频使用于mRNA疫苗开发，如4N4T(MIC1和MIC2，威斯津生物)、IC8(威斯津生物)、不饱和三烷基化脂质10(Genevant)和YK009(悦康药业)。

图3. 基于HTS筛选的代表性新型可电离脂质

除了高通量筛选HTS之外，探索可电离阳离子脂质和/或偶联靶向部分的构效关系(structure-activity relationships, SAR)，可以为指导LNPs的设计提供一条合理的途径。例如含咪唑(imidazole groups)的类脂质体经体内体外实验验证，可将mRNA递送至T淋巴细胞；杂环胺头基类脂质通过干扰素基因刺激物(STING)途径激活免疫细胞，显著提高了mRNA-LNP癌症疫苗的抗肿瘤疗效(图4E)。

来自塔夫茨大学的许巧兵教授团队通过在丙烯酰胺尾部基团中引入酰胺键，开发了名为“N-Series”的一系列LNPs，实现肺部选择性靶向(图4A)。该团队还受到神经递质(如色胺衍生物tryptamine derivatives)的血脑屏障(BBB)渗透机制启发，开发了由神经递质衍生的NT-类脂质LNPs，成功地将小分子药物、核酸和蛋白质通过血脑屏障传递到神经元细胞中，实现了有效的脑部递送(图4C)；

Drew Weissman和Michael Mitchell等人设计了由茴香酰胺(anisamide)获得的类脂质AA-lipidoids，可以有效结合活化肝星状细胞(HSCs)上过表达的sigma受体，用于治疗肝纤维化(图4B)。该团队还设计了一类双膦酸盐(bisphosphonate, BP)功能化的可电离脂质并成功制备BP-LNPs，小鼠实验显示可增强mRNA-LNP的骨微环境递送(图4D)。

图4. 通过SAR设计的可电离脂质，可用于特定组织/细胞靶向

2磷脂

磷脂是帮助脂质纳米颗粒自组装和内涵体逃逸的辅助脂质。在临床前研究和临床应用中，常用的磷脂是DSPC和DOPE。

程强与魏妥研究员早前与Daniel Siegwart等人开发了一类可电离辅助脂质iPhos，其含有两性离子头部和三个烷基尾部的独特结构更容易引起内体膜融合并促进载物释放，性能显著优于DSPC与DOPE。

另有研究表明，磷酸乙醇胺(PE)头基对增强LNPs的膜融合和内体逃逸具有重要意义，且带有极性的磷脂可以改变载体器官靶向性。

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胆固醇

胆固醇有助于增加LNPs的稳定性，并帮助细胞膜融合，优化胆固醇的结构也可以提高LNPs的递送效率并赋予LNPs特定的功能。

有研究在天然胆固醇类似物中筛选了显著提高转染效率的β-谷甾醇LNP(eLNP)，他们通过分析该胆固醇类似物的SAR，发现eLNP具有多面体结构形态并由不同的表面脂质组成，这可能有助于内涵体逃逸和mRNA释放。

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PEG脂质

聚乙二醇(PEG)脂质主要作用于减少纳米颗粒聚集，减少单核吞噬细胞吞噬，延长系统循环时间。然而PEG脂质也会阻碍于靶细胞的相互作用和内涵体逃逸，降低转染效率。

研究数据表明，碳链越短，解吸速度就越快，二烷基链的长度和聚乙二醇化脂质浓度/分子量显著影响LNPs在体内的药代动力学、药效学和生物分布。

PEG脂质也不可避免地带来了例如超敏反应、血液清除加速，以及重复给药引起的PEG抗体相关全身免疫原性。目前已开发了多种PEG替代脂质以提高LNP安全性有效性，包括聚甘油/poly(glycerol), 聚恶唑啉/poly(oxazolines), 和聚氨基酸/poly(amino acid)s。

LNP组分配方优化

2020年4月，Daniel Siegwart教授、程强研究员、魏妥研究员等在Nature Nanobitechnology期刊发表论文，开发了一种新型器官选择性靶向纳米颗粒平台——SORT。SORT递送系统通过在广泛使用的四组分LNP系统添加阳离子脂质(例如DOTAP)、阴离子脂质(例如18PA)或可电离脂质(例如DODAP)作为第五组分，可使mRNA选择性递送到小鼠的肺、脾或肝脏。2021年12月，他们在《美国国家科学院院刊》(PNAS)发表论文，解析了SORT系统能够实现器官特异性靶向递送的潜在机制，还利用iPhos脂质开发了新一代的SORT LNPs(iPLNPs)。

图5. SORT递送系统及其潜在机制

除LNP的脂质组成外，N/P（N为可电离阳离子脂质的胺基，P为mRNA的磷酸基）的摩尔比对LNP的性质也有很大的影响。在新冠mRNA疫苗中，N/P比值通常为3:1至6:1。随着N/P比值的降低，每LNP中mRNA的有效载荷会得到升高，但相应的mRNA包封率可能会降低，因此简单地增加N/P比率并不总是可取的，仍需要针对实际应用场景进行微调。

LNP表面修饰

表面修饰是赋予LNP功能的有效途径。特别是将抗体、多肽或其他分子（透明质酸、适配体、DNA、甘露糖等）偶联到LNP上可以提高其靶向能力。

Robert Langer团队优化靶向内皮细胞的LNP配方过程中，引入了内皮细胞特异性表达的甘露糖和GALA肽分子等靶向配体修饰LNP，有效实现了肝内皮细胞的精准靶向。