美国药典第二版mRNA疫苗分析指导方案解析（一）

相比第一版，新版指南草案从整个mRNA疫苗产品的全生命周期出发，基于QbD（质量源于设计）的理念，对原内容进行了修订和补充。内容主要涵盖了：

• 质粒DNA质量属性的测试 - Proposed testing for plasmid DNA prior to release

• mRNA药物原料的表征和放行测试 - Characterization and release testing for mRNA Drug Substance

• mRNA药物制剂的表征与放行测试 - Characterization and release testing for mRNA Drug Product

其中与高效液相色谱（HPLC）及液质联用（LC-MS）技术相关的分析手段被用于各阶段的多个项目中，是mRNA疫苗开发及生产中不可或缺的关键技术。

表1. 《mRNA疫苗质量分析方法-指南草案》（第二版）中的高效液相色谱及质谱技术摘录。

完整mRNA的分子量较大，在分析之前通常需用核酸酶进行酶切处理。选择性核酸酶RNase T1在G核苷酸的3''端裂解RNA序列，产生相对较短的寡核苷酸混合物，随后可通过LC MS/MS进行序列分析。mRNA的poly(A)尾部不包含G核苷酸，3''poly(A)尾以长度为100-150 nt的寡核苷酸形式从mRNA中释放出来。

图1. mRNA结构示意图。剪刀指示RNase T1的推断性酶切位点。

分离长度相差单个核苷酸的长链寡核苷酸对聚丙烯酰胺凝胶电泳、⽑细管凝胶电泳或⾊谱⽅法均构成挑战。沃特世高效液相色谱分析方案可使这些问题迎刃而解。

离⼦对反相液相⾊谱（IP-RP-LC）法是寡核苷酸分析的理想选择。目前的IP-RP-LC方法虽然能够轻松分离15-30 nt的短链寡核苷酸，但要分离长度40-60 nt的寡核苷酸已经较为困难，分离60-100 nt的寡核苷酸则更加困难。这是因为10 nt与11 nt寡核苷酸的电荷差异有10%，而100 nt和101 nt寡核苷酸的电荷差异仅1%，因此100/101 nt的分离选择性会降低。通过对的离子对试剂和色谱条件的优化，结合沃特世新推出的ACQUITY Premier BEH C18寡核苷酸分析专用柱(300 Å, 2.1×150 mm, 1.7 µm)，沃特世科学家开发出了可用于RNase T1酶解后EPO mRNA（TriLink）和Fluc Beta mRNA（AmpTech）分析的IP-RP-LC方法。酶解产生的2-30 nt短链寡核苷酸在5分钟前洗脱，在12~35 min之间洗脱的poly(A)物质。长度为124 nt的峰组（蓝色色谱图）代表EPO mRNA poly(A)尾的分析结果。红色的色谱图显示Fluc Beta mRNA poly(A)尾稍长，集中在128 nt峰附近。 

图2. IP-RP-LC方法分离100 nt合成腺苷标准品（黑色色谱图）、RNase T1酶解的EPO mRNA（蓝色色谱图）和Fluc Beta mRNA（红色色谱图）的结果。

使用100 nt腺苷标准品（图2，黑色色谱图），根据保留时间评估寡核苷酸的长度。合成的100 nt腺苷标准品包含从全长产物中分离出来的n-x短链杂质。我们对图2中标记的80、85、90、95、99、100和101 nt物质绘制了线性趋势L(nt) = a × tr + b。L(nt)相对于保留时间tr的线性校正曲线如图3所示。利用该趋势估计在EPO mRNA和Fluc Beta mRNA酶解物中发现的主要poly(A)尾峰的长度L(nt)（比较图2和图3）。

图3. 使用100 nt合成腺苷标准品及其截断序列（图2中的黑色色谱图；80、85、90、95、99、100和101 nt峰）建立校正曲线L(nt) = a × tr + b。根据该校正曲线计算mRNA样品中最主要的poly(A)尾峰的长度。

SEC体积排阻色谱是一种根据分子的流体动力学尺寸分离分子的方法。在SEC分析方法开发的过程中，沃特世科学家筛选了1.7或2.5 μm粒径的SEC色谱柱。实验结果发现ACQUITY UPLC BEH SEC 1.7 μm 125 Å色谱柱适用于分离2-25 nt寡核苷酸。ACQUITY Premier Protein SEC 250 Å 1.7 μm色谱柱适用于20-150 nt寡核苷酸，而ACQUITY BEH SEC 450 Å 2.5 μm色谱柱可有效分离50-4000 nt核酸。

图4. 用RNase T1消化857 nt EPO mRNA（红色色谱图）。消化产物、poly(A)尾和2 - 30 nt短寡核苷酸（蓝色色谱图）用ACQUITY Premier蛋白SEC 250 Å，4.6 x 150 mm，1.7 μm色谱柱分离。

基于这一初步研究，选择ACQUITY Premier Protein SEC 250 Å 1.7 μm色谱柱进行进一步实验。图4显示，该色谱柱能够出色地分离未消化的mRNA与mRNA RNase T1酶切产物。基于合成腺苷标准品的校准，Poly(A)尾的长度分布如图5所示。对于30–150 nt长度范围内的寡核苷酸，SEC峰保留时间计算与poly(A)尾长度的校准趋势呈现线性。

图5b显示了使用合成RNA寡核苷酸（A）标准品进行SEC色谱柱校准。30、40和60 nt样品表现出高纯度，而50 nt寡核苷酸和100 nt标准中检测到许多合成杂质。与寡核苷酸（A）标准品（图5b）相比，可以观察到明显的poly(A)尾峰前向和展宽（图5a），这是因为聚（A）尾的异质性导致的。SEC方法无法解析 N-x和 N x poly(A)尾部变体。然而，SEC UV方法确实提供了对聚（A）尾峰中存在的主要寡核苷酸长度的简单估计。

图5. a）1970 nt Fluc-β mRNA（红色谱图）用RNase T1酶解。用ACQUITY Premier蛋白SEC 250 Å，4.6x150 mm，1.7 μm色谱柱分离消化产物，poly(A)尾和2-30 nt短寡核苷酸（蓝色色谱图）。b） 使用合成 30、40、50、60和100 nt 寡核糖核苷酸 （A） 标准品进行 SEC校准。插图中显示了线性校准。校准曲线的外推用于近似更大的聚乙烯A尾的长度。

本次小编分享了能够简单、稳定地分析mRNA poly(A)尾长的IP-RP-LC/UV⽅法和SEC-UV方法。基于ACQUITY Premier SEC 250 Å蛋白分析专用柱进行poly(A)尾长分析，使用寡核糖核苷酸合成标准品进行SEC校准，结果在30-150 nt长度范围内呈线性。使用ACQUITY Premier BEH C18 300 Å寡核苷酸分析专用柱可以基于IP-RP-LC/UV分离长达150 nt的长链寡核苷酸，不需要进行质谱分析也可以作为潜在的质量控制分析方法。两种分离模式均采用了具有MaxPeak高性能表面的色谱柱，确保寡核苷酸物质获得稳定的回收率。

更多沃特世解决方案，请尽情期待我们下一期mRNA疫苗分析指导方案解析！