Nat Commun｜磷酸化蛋白组不会分析？本文一看便知

●期刊：Nat Commun

●发表时间：2023.02

●影响因子：17.6

研究概述

代谢组织未能对胰岛素做出适当反应（“胰岛素抵抗”）是2型糖尿病发病机制的早期标志。蛋白质磷酸化是脂肪细胞胰岛素反应的核心，但脂肪细胞信号网络如何因胰岛素抵抗而失调尚不清楚。本文使用磷酸化蛋白质组学来描述脂肪细胞和脂肪组织中的胰岛素信号转导。在一系列导致胰岛素抵抗的损伤中，观察到胰岛素信号网络的重构。脂肪细胞磷酸化修饰失调揭示了胰岛素抵抗机制。本文数据强调胰岛素抵抗是一种多节点信号缺陷，包括失调的MARK2/3和GSK3活性。

实验结果

用3T3-L1脂肪细胞构建了5种不同的胰岛素抵抗模型（图1a）。在急性（10分钟）胰岛素处理后，所有五种模型均导致脂肪细胞摄取放射性标记的2-脱氧葡萄糖(2DG)受损，从而证实细胞具有胰岛素抵抗性（图1b）。我们通过基于质谱的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析评估了对照和胰岛素抵抗脂肪细胞中蛋白质表达和胰岛素信号反应的变化（图1c）。检测到7564种蛋白质（图1d），以及对应于3791种蛋白质上的29,311个磷酸化位点的39,846种磷酸肽（图1e）。

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图1

在我们的磷酸化蛋白质组学数据中，我们检测到1,951个磷酸肽有差异（图1e）。在这些磷酸肽中有许多已知的胰岛素反应性磷酸化位点作为阳性对照。这些包括AKT1S1 T247、RPS6 S235/236、MTOR S2481、MAPK1 Y185、MAPK3 T203/Y205、GYS1 S641 和TBC1D4 S595。我们接下来考虑了蛋白质磷酸化的变化如何导致胰岛素抵抗（图1f）。一种模式是“有缺陷的磷酸化” ，由于胰岛素快速调节蛋白质磷酸化以实现其功能性结果，例如GLUT4易位，胰岛素调节磷酸化的缺陷可能导致胰岛素抵抗。另一种失调模式是“紧急磷酸化”，其中磷酸位点在对照条件下不被胰岛素改变，但仅在胰岛素抵抗时受胰岛素调节（图1f）。我们首先检查了有缺陷的磷酸化。在一种或多种胰岛素抵抗模型中，对照细胞中检测到的1,951种胰岛素反应性磷酸肽中有767种不受胰岛素调节（图1g）。这些缺陷的程度在模型之间有很大差异，从CI中的604个磷酸肽失调到MPQ中的仅43个（图1h）。在这1951种磷酸肽中，只有128种在三个或更多模型中存在缺陷，而在所有模型中只有7个存在缺陷（图1g）。这表明导致胰岛素抵抗的损伤不仅会减弱胰岛素信号，还会重新连接胰岛素反应信号网络。与缺陷信号相比，紧急信号事件在模型之间的保守性较低，在三个或更多模型中仅出现19个位点（图1i、j）。我们的深层蛋白质组和磷酸化蛋白质组的比较分析提供了探索信号改变是否与蛋白质丰度变化同时发生的机会。为此，我们将每个模型中的磷酸肽和蛋白质丰度变化与缺陷磷酸肽（图1k）或出现的磷酸肽的对照细胞进行了关联 。在所有模型中，无论胰岛素刺激状态如何，我们都观察到磷酸肽和蛋白质表达变化之间的相关性较差。这表明信号变化在很大程度上独立于由底物蛋白表达改变驱动的激酶-底物动力学变化。总的来说，我们的发现表明胰岛素抵抗实质上重新连接了胰岛素信号网络。

从机制上讲，在胰岛素抵抗中观察到的信号变化可能是由一种或多种蛋白激酶的失调引起的。为了找到失调的激酶，我们进行了激酶底物富集分析(KSEA)，评估胰岛素抵抗模型中体内有效激酶活性的变化。p70S6K被mTOR激活以响应胰岛素，并且两种激酶的激活曲线在不同模型中高度相关，表明我们的分析准确地捕获了激酶调节模式。在三种或更多种胰岛素抵抗模型ERK（CI、TNF、AA）和CDK5（CI、TNF、MPQ、AA，图2a）中，两种激酶显示胰岛素激活受损。与CTRL相比，胰岛素刺激的MAPK3/ERK1和MAPK1/ERK2激活位点磷酸化在CI、TNF和AA中显著减弱。该分析表明 ERK和CDK5的胰岛素激活受损可能导致胰岛素抵抗。

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图2

我们的整体分析表明，“胰岛素信号通路”中一部分的蛋白质的几种磷酸肽在多种胰岛素抵抗模型中存在缺陷，包括TSC1上的S502和DEPTOR上的S244。然而，KSEA显示，AKT（胰岛素刺激的GLUT4易位和葡萄糖转运的关键调节因子）以及下游激酶mTOR和p70S6K在对照细胞和胰岛素抵抗细胞中被激活（图2a）。虽然对照细胞蛋白质磷酸化增加，但胰岛素调节的去磷酸化在胰岛素抵抗中优先受损（图1g）。与磷酸化相比，蛋白质去磷酸化在一种或多种模型中出现缺陷的可能性更高（ 图1g）。这些有缺陷的去磷酸化实例通常是由胰岛素刺激的磷酸化蛋白质组的变化引起的，而不是由未刺激的磷酸化蛋白质组（基础缺陷）引起的（图1f）。总之，这些数据表明磷酸化减少受损是胰岛素抵抗的一个决定性特征。我们认为大多数模型中磷酸位点缺陷的蛋白质可能会导致胰岛素抵抗（图2e），我们假设MARK2/3可能负向调节GLUT4易位，发现siRNA介导的Mark2/3敲低或MARK2/3的药理学抑制增加了胰岛素刺激的GLUT4易位（图2f，g）。这些数据与在MARK2基因敲除小鼠的脂肪组织中观察到的胰岛素超敏反应一致。我们对胰岛素信号传导程度的了解还远未完成。我们的数据还表明，多个并行信号改变可能会累积导致胰岛素抵抗。

我们观察到胰岛素调节的去磷酸化在所有3T3-L1胰岛素抵抗模型中广泛失调（图1g）。急性磷酸酶抑制损害了3T3-L1脂肪细胞和脂肪外植体中2DG摄取，以及3T3-L1脂肪细胞中的HA-GLUT4易位。然而，我们在CI、DEX或TNF模型中检测到整体磷酸酶活性没有变化，并且特异性磷酸酶表达的变化仅限于胰岛素抵抗的慢性模型（CI，DEX、TNF）而不是急性模型（AA、MPQ）。在正常情况下，糖原合酶激酶3（GSK3）具有组成型活性，其在S9/21处被AKT磷酸化会使激酶失活。几种真正的GSK3底物在胰岛素抵抗模型中表现出去磷酸化受损，例如糖原合酶（CI和AA）上的S641，以及组蛋白乙酰转移酶Kat5（CI、DEX、TNF和AA）上的S86和S90。GSK3活性失调可能导致胰岛素抵抗中的去磷酸化受损。

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图3

我们接下来将274个推定的GSK3底物磷酸位点映射到我们的3T3-L1胰岛素抵抗磷酸蛋白质组上。我们发现这些数据集之间存在高度重叠，确定了191个相应的磷酸盐位点，这些磷酸盐位点在对胰岛素的反应中丰度下降，进一步支持这些位点在脂肪细胞中受GSK3调节。现在使用这些位点进行KSEA显示，在我们最初的磷酸化蛋白质组学研究中，GSK3在对照细胞中响应胰岛素而失活，这种失活在所有胰岛素抵抗模型中都减弱了（图3d)。

我们给小鼠喂食杂粮(CHOW)或高脂肪高蔗糖饮食(HFD) 14 天（胰岛素抵抗(HFD)） 。对于第三组喂食 HFD 14 天的小鼠，我们将饮食改回普通食物再喂食5天（胰岛素抵抗的逆转(REV)，图4a）。在喂食14天HFD的小鼠中，与CHOW组相比，胰岛素刺激的附睾脂肪组织中的2DG减少，而将小鼠恢复为饲料饮食5天后，胰岛素敏感性提高了约40%（图4b）。为了评估胰岛素信号，我们对来自用盐水或胰岛素处理的CHOW、HFD和REV小鼠的附睾脂肪组织进行了磷酸化蛋白质组学分析（图4c）。我们在CHOW小鼠的210种蛋白质上鉴定了319种胰岛素调节的磷酸肽（图4c）。胰岛素信号在HFD小鼠中显着重新连接，因为这319种磷酸肽中的203种在HFD中不再对胰岛素有反应，而一组单独的105种磷酸肽在HFD中显示紧急胰岛素调节（图4d)。203种有缺陷的磷酸肽中的大多数位于核心胰岛素信号通路之外（图4e），并且紧急磷酸化在转录调节因子中富集。在胰岛素刺激之前，与CHOW相比，HFD和REV组织中的GSK3活性降低（图4g），这可能是由于GSK3β上S9的抑制性磷酸化增加（图4h）。胰岛素刺激后，HFD中的GSK3活性升高（图4g）。与未刺激的组织相比，GSK3活性的这些变化在胰岛素刺激的组织中更为明显，即GSK3失调主要是由于胰岛素无法降低其活性。

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图4

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图5

科研延伸

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实测数据

1.检出数有保证

2.稳定性有保证

不同分组样本进行相关性分析、箱线图分析、PCA分析都显示较好的重复性和相关性。

直播预告