2023-04-17 17:42:47, 陈老湿 德国赛多利斯集团
尽管嵌合抗原受体(CAR-T)细胞改变了治疗B细胞恶性肿瘤的前景,但由于大多数肿瘤靶抗原是与正常细胞共享,导致了CAR-T对实体瘤治疗的毒副作用,所以在一定程度上阻碍了其在实体瘤治疗中的发展。因此,很多研究人员试图应用布尔逻辑门控(Boolean Logic Gate, 就是AND,OR,NOT)方法对CAR-T细胞进行预防毒性。
T细胞有两种CAR,针对两种肿瘤特异性抗原(TAA),两种CAR带有不同的传导信号激发因子。只有两种CAR同时结合两种TAA,才能共激发对肿瘤杀伤效应的信号转导称为AND;一旦结合一种正常细胞表达的抗原就不激发称为NOT;结合一种TAA就激发称为OR。
图1:Boolean Logic Gate对于CAR-T控制的示意图 [1]
最近的一篇来自于斯坦福大学的NATURE文章中[2],作者使用ZAP-70(一种细胞内近端T细胞信号分子)取代传统的CD3ζ 结构域分子,可以激活T细胞并在体内根除肿瘤,同时可以绕过上游信号传导。ZAP-70的主要作用是磷酸化LAT和SLP-76,于是将LAT和SLP-76设计成基于AND的逻辑门控细胞内网络(LINK CAR)。但是从这篇文章来看,这种AND设计并不是一帆风顺的。
这篇文章评估CAR-T细胞杀伤作用的主要方法用到了大家耳熟能详的Incucyte® 实时活细胞分析系统,Incucyte® 也成为这篇NATURE的核心技术。
仪器类型:Incucyte® S3
细胞自带红色荧光或者绿色荧光,每隔3个小时拍摄一次,共拍摄72小时,计算积分荧光面积的时间曲线。
图2:使用Incucyte® 进行免疫细胞杀伤实验,细胞质快速标记染料及细胞健康试剂(非本文实验图像)
评判标准:CAR-T只杀伤CD19、HER2双表达的细胞,对不表达或者单表达的细胞系不杀伤。体现在Incucyte® 的动态图谱上,就是曲线向上的速度越快代表越不杀伤,非常直观。
在设计AND逻辑门的CAR时,一个关键问题是如何避免出现自发二聚体,降低肿瘤杀伤的特异性作用。
首先,是对不同跨膜域的选择,考虑到如果用同样的跨膜结构域可能会产生二聚体,所以应尽量使用不同的跨膜结构域。基于此,作者首先研究了AA,BB,AB,BA四种跨膜域组合(A为CD28TM,B为CD8TM)。
图3:Incucyte® 实验显示,只有CD19-28TM-LAT+HER2-8TM-SLP-76(AB组合)显示出了一定的AND作用,但是仍然杀伤了CD19单阳。
为了进一步降低同源二聚或者异源二聚的可能性,突变了CD28TM上的一个半胱氨酸位点(2CA),但是仍然无法提高特异性。
图4:Incucyte® 实验显示,2CA突变没有提高特异性,依然对CD19单阳有杀伤
LAT和SLP-76不会结合,为什么还是不行呢?作者进一步研究了这个信号通路发现,下游的一个适配分子 GADS,可能会同时和两个CAR结合,所以依然会形成二聚体。所以将两个CAR上的GADS结合位点的敲除后,特异性就提高了,真正获得了AND效果!
图5:Incucyte® 实验显示:GADS结合位点敲除后获得了只对双阳杀伤的效果。
当然作者也尝试了其他抗原组合,比如CD19和ROR1,这种LINK CAR依然有效!
图6:Incucyte® 实验显示:2CA和GADS双突变的LINK只会杀伤ROR1和CD19双阳的细胞系
当然这种AND效果方法不只一个,比如SynNotch,但是相对于SynNotch,这篇文章的LINK显示出更佳的特异性。
这种CAR可以扩大CAR-T细胞靶向的分子范围,并将使CAR-T能够用于实体瘤和自身免疫等疾病和纤维化。此外,这项工作表明,细胞的内部信号机制可以重新利用为表面受体,其可能为细胞工程开辟新的途径。
为什么越来越多的高分文章
都使用了Incucyte® ?
培养箱内可长达数周的连续观察,最短几分钟间隔拍摄,减少人力,防止过多操作对细胞的伤害;本文每隔2个小时拍摄,拍摄3天。
6个板位,分别独立设置检测程序,可以兼容各种孔板和培养皿,通量高;本文有各种细胞系、CAR等实验组,Incucyte® 一次可以完成所有实验组实验
高效简便的模块化软件设置和数据分析,输出图片、视频、生长曲线等多指标多参数;本文提到了使用Incucyte® 多个参数的调节,使得结果更加准确
大于100种优化过的活细胞专用荧光试剂、耗材及详尽的Protocol;文章数大于13,000篇,是长时间活细胞成像主流设备之一
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下载应用文档,了解活细胞分析的演变以及增强式数据分析如何使活细胞分析成为一种可满足细胞治疗领域当前和未来需求的灵活解决方案。
-参考文献-
[1] Engineering CAR-T Cells for Next-Generation Cancer Therapy.Cancer cell,2020
[2] Co-opting signalling molecules enables logic-gated control of CAR T cells.nature,2023
-END-
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