项目文章 | 同济医院张子强团队运用AFADESI空间代谢组与微生物组联用探究肠道菌抗癌新机制~

2023年2月5日，同济大学附属同济医院张子强团队在Gut Microbes（IF= 9.434）在线发表了肿瘤微生态调控的最新研究成果“Microbiome and spatially resolved metabolomics analysis reveal the anticancer role of gut Akkermansia muciniphila by crosstalk with intratumoral microbiota and reprogramming tumoral metabolism in mice”。该研究通过微生态组学及AFADESI空间代谢组学等多个层面的研究，首次发现了肠道菌群和肺癌微生态之间潜在的全新调控作用，阐明了肠道/肿瘤菌群交互作用以及菌群参与调控肿瘤发生发展的关键机制。其中AFADESI空间代谢组学由鹿明生物提供技术支持；

本研究的前提有如下几点：

1.肠道菌群对肿瘤生物学有深远影响，比如口服双歧杆菌（Bifidobacterium）会增强PD-L1的治疗效果；

2.肿瘤组织内部也有微生物存在，称为瘤内菌群。它可能会调节癌症进展并影响治疗。但其具体影响很大部分还是未知的。

3.研究表明，肠道菌群中的梭菌（Clostridiales）可能有助于降低小鼠结直肠癌的尺寸，其效果取决于瘤内浸润以及随后的CD8+T细胞的激活。但目前对肠道菌群和瘤内菌群之间的关系，以及二者与肿瘤的相互作用还不清楚。

4. Akkermansia muciniphila（Akk）据研究对肿瘤和其他疾病具有有益作用，但机制不清楚。

因此，作者从空间分布的分子水平角度，通过Akk灌胃处理肺癌小鼠模型，研究了Akk对瘤内菌群转位及影响。

·肠道Akkermansia muciniphila 抑制Lewis肺癌小鼠模型中的肿瘤生长

图1 |  肺癌小鼠模型中的肠道微生物群落和多样性分析

首先为了确定内源性肠道微生物群与肺癌肿瘤发生之间的关系，作者使用了总共108只小鼠建立肺癌模型（样本策略）。并根据肿瘤生长情况，将小鼠分为普通肿瘤组（group1，n = 92），肿瘤延迟发育组（group2a，n = 16）以及无肿瘤发生组（group2b，n = 10）（图1a）。为了确定两组（group1和group2）之间肠道微生物群的分类组成和微生物多样性的差异，作者进行了α和β多样性分析。发现，group1的OTU（Operational Taxonomic Unit）丰度比group2高（图S1a）。

然而，反映物种丰富度和均匀度的Shannon和Simpson指数在group1和group2之间没有显著差异（图S1-c）。通过使用β多样性分析生成加权的UniFrac主坐标分析（PCoA），并显示了第1组和第2组之间的聚类情况（图1b）。发现，与普通肿瘤发生小鼠（group1）相比，延迟肿瘤发生小鼠（group2a）或无肿瘤发生小鼠（group2b）的肠道Akk（属于Verrucomicrobiales）和双歧杆菌（Bifidobacterium pseudolongum）明显升高（图1e）。这提示肠道菌群中的Akk和双歧杆菌可能对肿瘤生长有影响。因此作者接下来探究了Akk灌胃对肿瘤的影响。发现，灌胃Akk明显抑制了肿瘤的增殖，而Akk灌胃组和Akk+双歧杆菌灌胃组之间没有明显差异（图1f）。

·通过AFADESI-MSI方法进行空间分辨率代谢组学的代谢物分析

接下来，作者使用AFADESI空间代谢组对Akk对肿瘤的影响展开研究（图2a）。首先作者根据解剖学特征将样本分为三种区域：非坏死区、副坏死区和坏死区，同时，空间代谢组的聚类分析也清楚地显示出这些区域（图2b,c）。空间代谢组检测到的乳酸（图2d）和代谢（图2e）的分布与组织学分区高度一致。

图2 | 肺癌小鼠模型肿瘤切片中的代谢物分析

·Akk灌胃对肿瘤代谢的影响：映射出特定区域的代谢网络

接下来，作者通过将空间代谢组成像图与HE染色结果叠加，将这三个分区进行了选区比较分析，构建了一个代谢网络。确定了受影响的代谢通路，发现嘌呤代谢、谷胱甘肽代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、中心碳代谢、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢、丙酮酸代谢、糖酵解/葡萄糖生成、嘧啶代谢和脂肪酸生物合成等代谢通路在肿瘤组织中受到Akk灌胃的显著影响（图3c-e）。这些代谢通路之间存在密切联系，如谷氨酰胺代谢、嘌呤和嘧啶代谢、糖酵解代谢和谷胱甘肽代谢（图3f）。

图3 | 区域特异性代谢网络

·Akk灌胃对肿瘤代谢的影响：Akk调控糖酵解代谢

通过研究糖酵解途径的代谢物乳酸发现，肺癌组织中糖代谢失调，即乳酸的离子强度在整个肿瘤区域高度表达（图4a-e）。而灌胃Akk可以极大地降低了不同解剖学上的癌症亚区的乳酸水平（图4c）。IHC实验发现，作为调节糖代谢的酶，LDHA在癌区也是高度表达的，而Akk处理后则显著降低（图4f）。

图4 | 糖酵解代谢途径中关键代谢物和代谢酶的原位可视化

·Akk灌胃对肿瘤代谢的影响：Akk调控谷氨酰胺代谢

据研究，谷氨酰胺（glutamine，Gln）会显著富集于癌区。在本项研究中，作者发现，Gln的代谢在肺癌组织中明显失调，Glu、天冬氨酸、琥珀酸和苹果酸作为Gln的水解产物，在肺癌组织中急剧增加，然而，它们在Akk组明显下调（图5a，b）。这可能与谷氨酰胺酶（glutaminase，GLS）介导的谷氨酸（glutamate，Glu）水解有关，IHC实验发现，GLS在癌症组织中明显上调，而在Akk组中则明显下调（图5c），这与Glu的成像图很一致。

图5 | 谷氨酰胺代谢途径中关键代谢物和代谢酶的原位可视化

·Akk灌胃对肿瘤代谢的影响：Akk调控嘌呤和嘧啶代谢

核苷酸的合成可以通过各种代谢途径来调节，这些核苷酸是维持癌细胞快速增殖的必要营养物质。其中一个机制是通过加强糖代谢或Gln代谢来产生更多核苷酸合成所需的分子前体。MSI分析表明，核苷酸生物合成，如AMP、ADP、GMP和UMP，在对照组小鼠的肺癌中明显表达（图6a），同时核苷酸生物合成在Akk组的癌症组织中急剧下调（图6b）。

图6 | 通过关键代谢物的原位可视化和定量分析确定，灌胃Akk可下调核苷酸生物合成代谢

·Akk灌胃对肠道菌群的影响

另一方面，Akk灌胃后也可能会对肠道菌群组成造成影响。接下来，作者通过16S DNA测序分析了肠道菌群，发现，对照组和Akk组小鼠的肠道菌群组成没有明显差异（图7a-c），二者共有的OTU有1988个（图7e）。为了确定与Akk相关的特定微生物群落，进一步分析发现，在属的水平上，发现Akk的丰度在Akk灌胃小鼠的肠道微生物群中升高，而在对照组小鼠的肠道微生物群中，肠杆菌（Enterobacterales）、螺旋杆菌（Helicobacter）、类杆菌（Bacteroidota）的丰度增加（图7f）。

图7 | Akk灌胃后对小鼠肠道菌群的影响

·Akk灌胃对肿瘤菌群的影响

本文之前的研究发现，Akk灌胃后会对肺癌及肠道菌群组成造成一定影响，那它是否也会影响瘤内菌群。为解决这个问题，作者同样用16s DNA测序分析了瘤内菌群。发现对照组和Akk组的菌群组成没有明显差异（图8a），二者共有278个OTU（图8c）。通过LEFSe分析，作者发现，在门类水平上，Akk灌胃组肿瘤中Bradyrhizobium、Vibrionimonas Verrucomicrobiales和Lactobacilius的丰度增加，而Gammaproteobacteria、Sphingomonadales和Acidobacteriae的丰度则在对照组中富集（图8d-e）。Akk组肿瘤组织中Akk的丰度升高了（图8d-8f）。

此外，为了比较不同样品的微生物组成，作者又设立了5个组，分别是Lewis肺癌细胞（Cell），对照组小鼠的粪便样品（CFA），对照组小鼠的肿瘤组织样品（CT），Akk灌胃小鼠的粪便样品（AFA），Akk灌胃小鼠的肿瘤组织样品（AT）。作者比较和分析了这些组中富集的前100个微生物群。如图S7a所示，与肠道微生物群的组成不同，肿瘤组织中的主要微生物群，如Staphylococcus、Vibrionimonas、Bacillus和Rhodanobacter在肠道中并不明显。通过进一步比较CT、AT和Cell组中瘤内菌群，发现与Lewis细胞样本相比，Akk灌胃小鼠肿瘤组织中的Akkermansia、Lactobacillus、Bifidobacterium、Staphylococcus和Bacteroides（用红色箭头条标记）都明显增加。另一方面，这些常见的肠道微生物群在用于肺癌小鼠模型的Lewis细胞系中未被检测到。这些结果表明，肿瘤微生物群包含更多的Akk和其他"肠道微生物"，它们可能来自于肠道。

图8 | Akk灌胃后对肺癌小鼠模型瘤内微生物组的影响

·肠道和肿瘤微生物群之间的相互作用:肠道细菌可能通过体循环进入肺癌组织

上面的结果提到，肠道Akk和瘤内微生物群之间的正相关关系表明，可能存在肠道细菌向癌症组织的潜在转移。因此，作者想探究这种转移是否是通过血液循环。通过对血液进行16s DNA测序，作者发现，在系统级，灌胃细菌的小鼠血样中Verrucomicrobia（Akk属于Verrucomicrobia）和Bifidobacteriaceae的丰度增加（图9a，b）。在属的层面上，灌胃后2小时，在血液中Akk和双歧杆菌丰度出现升高，而6小时后，不能明显检测到Akk或双歧杆菌（图9c）。

图9 | 血液循环中肠道细菌的检测（对照组（CB），Akk灌胃组（AB））

·差异肿瘤微生物群和差异代谢物之间的关联

最后作者用spearman相关性分析了肿瘤组织中的差异菌属和代谢物之间的关联（图10）。发现，Acidobacteriaceae在对照组小鼠的肿瘤组织中富集，它们与非坏死肿瘤组织中糖酵解代谢途径中的差异代谢物（乳酸）表现出明显的正相关。对照组小鼠肿瘤组织中的Acidobacteriales或Acidobacteriaceae与非坏死肿瘤组织中Gln（谷氨酸、琥珀酸和苹果酸）和腺苷代谢（AMP、ADP、UMP、GMP和尿酸）途径的不同代谢物表现出明显的正相关，Akk灌胃的肺癌小鼠的肿瘤组织中富含的Bacteroides、Dubosiella和Methylovirgula则表现出明显的负相关。结果表明，这些Akk共生细菌很可能在Gln和腺苷代谢中发挥调节作用。

图10 | 差异菌群与差异代谢物的关联分析

本研究结果显示，肠道Akk可能通过血液循环迁移和定植到肺癌组织，并随后影响肺癌的共生微生物组。重要的是，肠道Akk与肿瘤微生物组的互作可能通过代谢重编程形成有利的抗癌微环境，因此，肿瘤微生物组可能作为癌症结果的预测因素。此外，空间分辨率的代谢组学分析可以作为一种新的方法来探索肠道微生物组通过调节肿瘤代谢的抗癌作用，并在分子水平上（从代谢物到酶）获得对肠道微生物组调节的癌症代谢重编程的新认识。

本文主要运用16 s微生物组以及AFADESI空间代谢组技术，探究了Akk灌胃后对瘤内菌群的影响，以及对肿瘤代谢的影响，进而探究了Akk影响肿瘤的可能机制。AFADESI空间代谢组可以检测到有机酸、氨基酸、嘧啶及嘌呤等物质，并对其进行原位成像。此外，通过空间聚类分析可以清晰展示区域特异性，有力地解决了通过手术方式或激光切割精确分割癌区的难题。

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