项目文章 | 单细胞转录组测序解析急性肺损伤中性粒细胞的表型转化及其潜在调控机制

2022年12月13日，同济大学附属东方医院李强教授团队在Nature Communications（IF：17.694）上在线发表了题为“Locally organised and activated Fth1^hi neutrophils aggravate inflammation of acute lung injury in an IL-10-dependent manner”的文章，该研究揭示了急性肺损伤中性粒细胞的表型转化及其潜在调控机制。

本文利用单细胞测序结果首次揭示了在ALI小鼠肺部的两组显著异质的中性粒细胞亚群，并研究了这两种亚型在ALI病理过程中的不同作用及在ARDS患者肺部的比例变化。该研究结果为肺部中性粒细胞表型变化填补了知识空缺，为评估ARDS预后提供了新的生物标志物。欧易生物提供了该项目的单细胞转录组测序实验和分析工作。

接下来，我们具体解析一下该项目的研究思路和实验内容。

Result1 IL-10缺乏加重ALI小鼠急性中性粒细胞炎症

为了探讨IL-10在ARDS中中性粒细胞介导的炎症过程中的活性，作者对野生型（WT）和Il-10^−/−小鼠分别用LPS或PBS处理诱导ALI小鼠模型，在给药后6h、12 h和24 h分别进行测序分析（图1a）。如图1b-e所示，LPS诱导了BALF中蛋白的积累和炎症细胞（特别是中性粒细胞）的浸润，12 h后IL-10的消耗进一步加剧了这种情况。此外，BALF上清液和血清中的IL-6、TNF和CSF等促炎因子在6-12小时内迅速升高（图1f-i），IL-10缺乏加剧促炎因子升高。有趣的是，6h后IL-6、KC和TNF促炎因子的表达量在IL-10^−/−-LPS小鼠中的数值高于WT-LPS小鼠，提示IL-10在ALI急性炎症中可能具有保护作用。

图1 IL-10消耗加重了LPS刺激后中性粒细胞主导的炎症

作者进一步研究了IL-10在脂多糖诱导的ALI过程中对肺细胞环境的影响，结果表明，在生理条件下，IL-10缺乏不会引发肺部炎症，然而，LPS诱导24 h后广泛加重了ALI（图2a，b）。

  为了评估脂多糖介导的肺损伤中中性粒细胞依赖的积累和激活，作者用Ly6G、髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）对小鼠肺切片进行染色处理。与WT小鼠相比，接受LPS刺激后Il-10^−/−小鼠中浸润的中性粒细胞表达以上三种蛋白水平都相对更高（图2d-i）。此外，作者进一步用致死剂量的LPS（25 mg/kg）评价了IL-10消耗对ALI小鼠存活率的影响：IL-10^−/−小鼠的存活率（26.7%），低于WT小鼠（66.7%），提示IL-10水平可能对ALI/ARDS预后产生影响。

图2  IL-10缺乏加重了LPS引起的广泛性肺损伤

Result2 WT和Il-10^−/−ALI小鼠的中性粒细胞群体具有不同的组织分布模式

作者对LPS或PBS吸入24小时的WT和Il-10^−/−的小鼠肺组织进行了scRNA-seq，获得了正常和病理条件下小鼠肺的高分辨率细胞图谱，主要包括上皮细胞（Epcam）、内皮细胞（Pecam1）、成纤维细胞（Col1a2）、中性粒细胞（Ly6g）、单核巨噬细胞（Fcgr1、Mrc1）、淋巴细胞T细胞（Cd3e）、淋巴细胞B细胞（Cd19）、树突状细胞（Cd83）和自然杀伤细胞（Klrb1c）（图3d-f）,并对这些细胞类型进行了分组间差异基因及功能富集分析（图3g）。

图3 通过单细胞RNA测序鉴定小鼠肺组织中不同的细胞群

其中，中性粒细胞占比最高，且LPS刺激后中性粒细胞比例增加，并且在WT和Il-10^−/−ALI小鼠肺中可以发现中性粒细胞存在明显差异。将其进一步进行亚群分析获得7个中心粒亚群，包括N1，N2，N5，N6，来自Il-10^−/−ALI小鼠；N3、N4、N7，来自WT小鼠（图4a，b）。对每个群体进行了单细胞差异表达分析，并检测了N1-N5和N6-N7的特征基因表达模式（图4c）。基于其特异富集的基因，进一步将ALI肺中的中性粒细胞分为两个群体：N1、N2、N5（Il-10^−/−）和N3、N4（WT）高表达Fth1和其他基因（Il12a、Adora2b等），因此被称为Fth1^hi Neu；N6（Il-10^−/−）和N7（WT）高表达Prok2，以及Scrg1和Serpinb1a，定义为Prok2^hiNeu（图4d-g）。

接下来，作者通过免疫组化和免疫荧光验证实验证实Fth1在支气管、肺泡腔和隔膜内的中性粒细胞中表达增多，但在血管中未见（图4h-j，n）。相反，Prok2优先在血管中的中性粒细胞中表达（图4k-n）。综上所述，ALI肺似乎由两个主要的中性粒细胞群体组成：Prok2^hiNeu（一个定位于肺血管内的少数群体）和Fth1^hiNeu（大多数群体广泛分布在气道内或气道周围）。

图4 ALI小鼠肺内中性粒细胞的转录和分布异质性

Result3 ALI小鼠肺中的Prok2^hi Neu和Fth1^hi Neu亚群在功能和形态上具有异质性

为了表征ALI小鼠肺中发现的两个中性粒细胞群的功能异质性，作者对其进行了GO和KEGG通路富集分析。大多数生物学过程在两个中性粒细胞亚群中是相同的，有趣的是，Prok2^hi Neu在凋亡和铁下垂通路等几个特定的功能通路中富集，而这些通路在Fth1^hi Neu中几乎检测不到，这表明在肺组织可能保护Fth1^hi Neu免于程序性细胞死亡。形态上，Prok2^hi Neu显示出环状核，而Fth1^hi Neu倾向于有一个多小叶甚至超分节的细胞核（图5c）。

与趋化性、促炎细胞因子、凋亡抑制剂、维持铁稳态和抗氧化应激相关基因在Fth1^hi细胞中表现出较高的表达。而Prok2^hi Neu表现出了抗菌先天免疫、对病原体的防御反应、清除凋亡的基因表达特征和糖代谢过程（图5d）。此外，作者进一步比较了上述基因的在肺血管和外周血中的表达模式，结果显示Prok2^hi Neu与外周血中性粒细胞具有相似但不相同的功能表型（图5e）。

图5 ALI肺中两个中性粒细胞亚群的功能和形态学异质性

Result4 Fth1^hi中性粒细胞导致il-10缺失小鼠更严重的肺损伤

作者前期研究结果表明，IL-10通过控制中性粒细胞主导的炎症反应减轻ALI肺的弥漫性损伤。因此，作者猜测IL-10是否可能在LPS刺激后协调这两个中性粒细胞簇的不同功能。与WT小鼠相比，Il-10^−/−中Fth1^hi Neu，而不是Prok2^hi Neu升高（图6a，b），与此同时外源性IL-10抑制了Fth1^hi Neu对ALI肺的浸润。

为了进一步验证ALI小鼠肺中这两个中性粒细胞亚群对IL-10的潜在差异反应，作者收集了BALF的中性粒细胞，发现Prok2在BALF中性粒细胞中几乎没有检测到（图6e）。此外，Fth1在肺和BALF中与肺损伤评分呈正相关（图6c，f）。因此，Fth1^hi Neu可能是ALI肺炎症损伤受IL-10影响且病情加重的原因。

图6 Il-10^−/−延长肺Fth1^hi Neu的生存期，加重肺损伤

图6 Il-10^−/−延长肺Fth1^hi Neu的生存期，加重肺损伤

Result5  中性粒细胞中Fth1和Prok2表达比例的增高可作为肺部感染不良预后的潜在标志

为了探讨以上研究结果的临床相关性，作者收集了住院患者BALF（n=24）的气道中性粒细胞，其中7例在入院48小时内发展为ARDS。作者发现与未发生该综合征的高危患者相比，BALF中性粒细胞中ARDS患者的Fth1表达增加，而Prok2表达降低（图7）。这些发现支持了Fth1^hi Neu和Prok2^hi Neu在ARDS中的潜在功能差异，并提出在肺部感染患者的BALF中性粒细胞中，Fth1和Prok2的高比例表达可作为短期不良预后标志的可能性。

图7 肺部感染患者BALF的中性粒细胞里Fth1的高表达和Prok2的低表达可能是不良预后的一个潜在标志物

参考文献：

Wang Kun et al. Locally organised and activated Fth1^hi neutrophils aggravate inflammation of acute lung injury in an IL-10-dependent manner.[J]. Nature communications, 2022, 13(1) : 7703-7703.

（DOI:10.1038/s41467-022-35492-y）

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排版人：小久

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