项目文章 | 多组学分析揭示了锰暴露影响斑马鱼大脑的铁死亡途径

1.Mn暴露后斑马 鱼大脑的单细胞图谱

在斑马鱼大脑中鉴定出21个细胞簇（图1A）。根据特定的标记基因将细胞分为10种主要类型：胆碱能神经元(en1b，en2b，arhgdig和plscr3b)，DA神经元(txnrd3，pbx1a，prdx1和txn)，谷氨酰胺能神经元(pou4f2，slc5a7a，bcl11ba和sst6)，GABA能神经元(gad2，kcnip1b，fj49c03和camk1db)，神经元前体(rrm2，ube2c，cdk1和aspm)，其他神经元(elavl3，elavl4，sncb和sv2a)，小胶质细胞(cd74a，mpeg1.1，slc7a7和fcer1gl)，少突胶质细胞(olig2，sox10，ugt8和flj13639)，放射状胶质细胞(slc1a2b，cx43，ptgdsb.2和crtac1a)，以及未定义的细胞(图1B)。图1C显示了每个细胞簇中标记基因的表达。各组中各细胞类型所占比例见图1D。

与对照组相比，低暴露组胆碱能神经元比例增加0.347%，高暴露组减少3.405%；低暴露组DA神经元增加0.251%，高暴露组减少1.186%；低暴露组和高暴露组GABA能神经元分别显著增加4.449%和3.373% (p<0.05)。这些结果表明，Mn暴露可改变胆碱能神经元、DA神经元和GABA能神经元的细胞类型比例。

图1 斑马鱼脑的单细胞图谱

2.Mn暴露影响斑马鱼脑中神经元类型的分化轨迹

进一步分析了不同亚型的神经元，得到了12个亚群(图2A)。四种神经元类型独立分布在不同的亚群中。拟时序分析表明随着Mn剂量的增加，神经元逐渐趋向轨迹的末端（图2B）。与细胞类型的拟时序分析结果相比，对照组以DA能神经元和胆碱能神经元为主，而Mn暴露后，神经元类型依次以GABA能神经元、谷氨酰胺能神经元和未定义中间体为主。根据拟时序轨迹排序，显著变化的基因聚类到三个模块，对其进行GO富集分析，结果表明下调基因主要富集在核糖核蛋白复合体的生物发生、蛋白质折叠、细胞代谢过程、G蛋白偶联受体信号通路以及对温度刺激应答等方面。281个下调基因与细胞代谢密切相关(簇1)。上调基因(簇2)富集到ATP代谢、大分子生物合成过程、G蛋白偶联受体活性、昼夜节律和电子传递链。根据显著改变的基因表达和相应的功能，分析簇3基因属于过渡期（图2C）。因此，拟时序分析表明，Mn暴露改变了主要细胞类型，从DA能神经元转变为GABA能神经元，同时，Mn暴露动态改变了与细胞代谢过程相关的不同遗传程序。

图2 聚类和拟时序识别斑马鱼脑中神经元细胞的转录动力学

3.Mn破坏了斑马鱼脑神经元的铁死亡信号通路

为了探索Mn神经毒性的转录调控机制和代谢途径，首先鉴定了Mn暴露后神经元中的差异表达基因。在低暴露组中，谷氨酰胺能神经元中有289个差异基因，DA能神经元中有170个，GABA能神经元中有49个，胆碱能神经元中有27个差异基因（图3A）。在高暴露组中，所有类型的细胞中有更多的差异基因，多巴胺能神经元中有413个，谷氨酰胺能神经元中有141个，在GABA能神经元中有107个，在胆碱能神经元中有66个（图3B)。OPLS-DA模型显示，在低暴露组检测到66个差异表达代谢物，在高暴露组检测到63个(图3C-F)。

图3 Mn暴露后斑马鱼脑的转录和代谢重编程

利用联合通路分析对每种类型神经元中差异表达基因和代谢物富集的代谢通路进行了分析(图4A、B)。结果表明，随着Mn剂量的增加，细胞代谢途径发生了显著变化。在低、高暴露组中，多种细胞类型中都富集到了甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、谷胱甘肽代谢以及精氨酸和脯氨酸代谢途径。并且在两个暴露组中，差异基因显著影响了DA神经元的更多代谢途径。代谢组学结果表明，Mn影响了参与脂肪代谢、氨基酸代谢和葡萄糖代谢途径的代谢物水平，特别是在DA神经元中。

为了探究Mn暴露后神经元代谢通路的靶向信号通路，进行了KEGG通路分析。高暴露组中，在胆碱能神经元中富集到62条通路，GABA能神经元中富集到43条通路。高暴露组的DA神经元富集到的134条通路中，铁死亡通路包含12个差异基因和3个差异代谢物。在低暴露组，7个差异基因和3个差异代谢物也富集到铁死亡途径中。代谢物谷氨酸和GSSG随Mn暴露剂量的增加而增加，而GSH则呈下降趋势。在DA神经元中，Mn暴露后hmox1b基因的表达显著增加。同时，gpx4a、slc40a1和sat1a.2的表达随Mn浓度成比例降低。

此外，acsl2、gclc、slc3a2b、ncoa4和map1lc3c1的表达仅在高暴露组显著降低。相比之下，铁储存相关基因fth1a的表达在低暴露组略有上升，在高暴露组下降。同时，在Mn暴露后的其他神经元中，未发现铁死亡相关基因表达有显著差异。因此，过度暴露于Mn可以显著改变铁死亡途径中的代谢物和基因，尤其是在DA神经元中。

图4 多组学联合分析Mn干扰斑马鱼脑内神经元铁死亡信号通路

【参考文献】

Budinger, D., Barral, S., Soo, A., Kurian, M.A., 2021. The role of manganese dysregulation in neurological disease: emerging evidence. Lancet Neurol. 20 (11), 956–968.

Tinkov, A.A., Paoliello, M., Mazilina, A.N., Skalny, A.V., Martins, A.C., Voskresenskaya, O.N., Aaseth, J., Santamaria, A., Notova, S.V., Tsatsakis, A., Lee, E., Bowman, A.B., Aschner, M., 2021. Molecular targets of manganese-induced neurotoxicity: a five-year update. Int. J. Mol. Sci. 22 (9).

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排版人：小久

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