项目文章|肠道微生物群通过免疫调节介导替莫唑胺对神经胶质瘤的个性化疗效

2023-04-12 13:36:18, 小迈 武汉迈特维尔生物科技有限公司



迈博士有话说

本文应用了多组学(微生物+代谢组)的研究策略,为该类思路提供了讨论范例。同时,在有效结果的基础上,文章展示了几处亮点。一是作者将代谢组数据作为微生物菌群变化的验证结果,文中除了分析16srRNA数据表明胶质瘤影响小鼠肠道菌群的群落结构,其次作者还利用菌群的代谢结果二次证明了菌群的变化,加强了结果的可靠性;二是作者多次将菌群和代谢结果与TMZ药效学指标相互关联,印证TMZ治疗效果与肠道菌群有着不可分割的关系。三是作者对TMZ治疗后的患者进行了分层,并且运用了ABX广谱抗生素建立无菌鼠,证实了菌群在TMZ疗效中中发挥着重要作用。所以,此文不失为一篇较好的学习资料,供大家认真研读。



●期刊:Journal of Translational Medicine

●发表时间:2023-03-16

●影响因子:8.440


近日,江汉大学研究团队在著名期刊Journal of Translational Medicine发表篇名为《Gut microbiota mediated  the individualized efcacy of Temozolomide  via immunomodulation in glioma》的研究文章,该研究采用Luci-GL261胶质瘤原位异种移植模型联合生物发光成像技术评估TMZ和分化TMZ敏感(S)/非敏感(NS)个体的抗肿瘤效果,并且采用微生物和代谢组学联合研究肠道细菌在TMZ敏感性中发挥的作用,除外还采用抗生素治疗联合TMZ治疗来证实了微生物群落不可或缺的作用。本研究融合了肠道微生物群参与胶质瘤的发展和通过免疫调节的个体化TMZ融合,进而得出肠道细菌可以作为一种预测的生物标志物和临床TMZ应用的治疗靶点。这项工作为提高TMZ治疗神经胶质的敏感性提供依据迈维代谢为本研究提供非靶向代谢组和16S的检测服务。

研究背景

替莫唑胺(TMZ)是治疗胶质瘤的首选化疗策略。作为第二代烷基化剂,TMZ提供了优越的口服生物利用度。然而,有限的缓解率(不到50%)和高耐药发生率严重限制了TMZ的应用,目前仍缺乏提高化疗敏感性的策略。越来越多的证据表明,肠道菌群及其衍生代谢产物可以调节癌症的发展和化疗疗效,本研究旨在通过综合微生物学和代谢组学分析,揭示肠道菌群在胶质瘤发展中的潜在作用以及TMZ的个体化疗效。

研究思路



实验结果


1多组学研究表明,胶质瘤的发展导致小鼠肠道菌群失调

为了探讨肠道菌群在胶质瘤发展中的作用,作者构建了Luci-GL261胶质瘤原位异种移植模型。在第14天通过生物发光成像验证异种移植模型(图1A),同时采集Control组和Model组大鼠粪便标本,进行16s rRNA测序(第14天)。通过α-多样性和β-多样性分析显示虽然胶质瘤的发展并没有导致整体微生物群落丰富度的显著变化,但是Control组和Model组肠道的群落结构和组成有明显的差异(图1B)。其中Control组以厚壁菌门(Firmicutes,平均占35.58%)为主,而Model小鼠以拟杆菌门(Bacteroides,平均占52.16%)为主。在属的层面上,相似百分比分析显示Akkermansia, Bifido-bacterium, Ligilactobacillus等是Control小鼠和Model小鼠之间变异性的关键因素,通过KEGG途径富集分析显示,在Control组小鼠中ABC转运蛋白表达富集,而Model组小鼠聚酮糖单元生物合成鞘糖脂生物合成和氨基酸代谢等代谢途径增加(p<0.01)(图1D)。


作者为了研究微生物群相关代谢物在胶质瘤发展中的潜在作用,通过LC-MS非靶向代谢组学分析了Control组和Model组的粪便中的代谢物。通过VIP > 1、p < 0.05和fold change> 2的阈值对于两组的差异代谢物进行了筛选(图1E,F)。共鉴定出64种代谢物,主要包括氨基酸、短链脂肪酸(SCFAs)、脂肪酸、胆汁酸、二肽等。此外,KEGG富集分析发现主要参与了色氨酸/谷氨酸代谢、亚麻酸代谢、脂肪酸生物合成途径。综上所述,多组学研究表明,在胶质瘤的发展过程中,肠道菌群有很大的变化。




    

图1 胶质瘤诱导小鼠肠道菌群及相关代谢产物失调。A.模型组小鼠胶质瘤原位异种移植模型构建及第14天代表生物发光图像(BLI)的工作流程。B. weighted-wilcox法评价对照组和模型组肠道菌群β多样性指数。C.对照组和模型组细菌在门和属水平上的分类分布。D.对照小鼠和模型小鼠肠道菌群KEGG通路丰度不同。E基于代谢组正负离子模式数据的OPLS-DA评分图。F.对照组和模型组间正负离子模式下差异代谢物火山图(FC>2p<0.05)


2TMZ治疗改变了肠道菌群分布,增加了其多样性

上述已经观察到的肠道菌群失调与胶质瘤之间的联系,接下来作者继续探索了TMZ治疗(胶质瘤标准化疗)对小鼠肠道菌群的影响。收集TMZ治疗前(Model,14d)和治疗后(TMZ,21d)的粪便样本,进行16srRNA测序和代谢组学分析(图2A)。结果发现TMZ治疗逆转了胶质瘤诱导的肠道微生物群失调。TMZ处理后,微生物群落丰富度和多样性升高(Chao1、Shannon和Simpson,p<0.001)(图2B)。同时,两组间β-多样性也有显著差异(p<0.01)(图2C)。在门水平上,TMZ小鼠以厚壁菌门(Firmicutes)为主(平均占52.04%),而Model组以拟杆菌门(Bacteroides)为主。其中,Model小鼠和TMZ小鼠肠道Akkermansia、Ruminococcus、Lactobacillus等17个细菌属存在显著差异。此外,通过KEGG途径富集分析显示,两个聚类之间氨基酸、脂质、葡萄糖和核苷酸代谢活性存在差异。粪便样本的非靶向代谢组学分析进一步支持TMZ治疗后肠道细菌代谢谱的改变(图2D)。在Model小鼠和TMZ小鼠之间,氨基酸、寡肽、胆酸、短/长链脂肪酸等61种代谢产物有显著差异(VIP>1, p<0.05,FC>2) (图2E),总之,这些结果证实TMZ逆转了由胶质瘤原位异种移植引起的肠道菌群失调,并增加了肠道菌群多样性。


    

图2 TMZ可引起肠道菌群分布的显著变化。A.脑胶质瘤原位异种移植模型构建及TMZ治疗的工作流程。B. TMZ 治疗前后小鼠肠道菌群Chao1、Shannon和Simpson指数α-多样性指标。C.通过weighted-wilcox评估Model和TMZ组小鼠之间的肠道微生物群的β-多样性指数。D.基于正负离子模式的OPLS-DA评分图。D.模型和TMZ组间正负离子模式下差异代谢物火山图(FC>2和p<0.05)


3TMZ敏感和非敏感个体给药前粪便样品肠道微生物群结构和代谢产物有显著差异

作为胶质瘤化疗的一线治疗策略,TMZ反应的高度异质性导致一些患者预后不良。最近的研究显示,MGMT突变,肿瘤免疫微环境,炎性体和PI3K/Akt途径在内的多种因素可能有助于个性化TMZ疗效,但目前仍然缺乏增加化疗敏感性的策略。以上的研究结果充分证实了肠道微生物群参与胶质瘤的发展和TMZ治疗。然而,肠道微生物群是否能介导荷瘤小鼠对TMZ的敏感性尚不清楚。为了探究此问题,作者随后构建Luci-GL261胶质瘤原位异种移植模型(7d),在肿瘤注射后7天(14d)将小鼠随机分为Model组(n = 10)TMZ(n = 40)(3A)Model组和TMZ组均导致荷瘤小鼠体重显著降低(3B).根据肿瘤抑制率(21天的肿瘤通量/14天的肿瘤通量),将TMZ处理的小鼠分为TMZ敏感组(抑制率>30%n = 13)TMZ非敏感组(NS组,抑制率<-200%n = 14)(图3C)。结果显示TMZ治疗组与NS组在抗肿瘤作用上有显著性差异。同时,TMZS组小鼠的肿瘤转移和Ki67水平也受到显著抑制(3D).这些结果证实,其他关键因素参与TMZ的功效导致TMZ可以有效地作用于具有TMZ耐药的GL261细胞。


    

3 TMZ敏感(S)和非敏感(NS)个体的识别。A.胶质瘤原位异种移植模型构建及TMZ治疗流程。B.神经胶质瘤发展和TMZ给药对小鼠体重的影响。C.TMZ S (n = 13)NS (n = 14)小鼠的肿瘤抑制率(相对总通量(Flux14/Flux7天))评价TMZ的疗效。D. SNS小鼠的代表照片、BLI图像、HE染色和免疫组化(Ki67)


为了探究肠道微生物群和相关代谢物是否有助于TMZ治疗胶质瘤的敏感性,作者通过对来自S组和NS组的粪便样品进行16s rRNA基因测序分析和非靶向代谢组学分析,结果显示S组和NS组之间的α-多样性(Chao1, Shannon和Simpson指数)没有显着差异(图4A),但是β-多样性指数显示肠道菌群分布具有显著的差异(图4B)。NS中Bacteroides丰度(59.05%)明显高于S组(38.97%),这一结果与模型组Bacteroides丰度(52.16%)高于对照组(33.54%)相一致(图4C)。进一步的筛选显示,在S和NS小鼠之间的肠道微生物类群中,Akkermansia,Alloprevotella,Muribacula,Desulfovibrio的丰度差异最大(图4C),同时,代谢组学分析也显示出S与NS组小鼠的肠道微生物群相关的代谢水平显著不同(图4D),在色氨酸代谢、类固醇生物合成和鞘脂代谢水平等通路都有显著差异。并且Spearman相关分析表明,粪便样品中变化的细菌和代谢物的丰度之间存在显著的相关性且都与药效学评价指标显着相关(图4E)。总之,本节描述了来自TMZ敏感和非敏感个体的肠道微生物群具有不同分布和功能,而肠道细菌对于TMZ功效的潜在作用需要进一步探索。


    

图4 不同的肠道菌群分布和代谢物可能有助于个体化TMZ疗效。A.TMZ S和NS小鼠肠道菌群Chao1、Shannon和Simpson指数α-多样性指数。B.通过weighted-wilcox评估TMZS和NS个体肠道菌群β多样性指数。C.基于正负离子模式的OPLS-DA评分图表明在S和NS小鼠之间细菌属发生显著变化。E.TMZ处理后药效学指标与变化细菌属/代谢物丰度的Spearman相关系数热图。


4对TMZ治疗反应不同的小鼠免疫浸润有明显差异

有研究表明免疫逃逸是胶质瘤的特征之一,而肠道菌群可通过免疫系统调节介导疾病发展和药物反应。我们推测肠道细菌通过免疫调节影响TMZ敏感性。因此,我们分别研究了TMZ敏感小鼠和非敏感小鼠在第21天的血清IL-1β和TNF-α浓度,在敏感个体中IL-1β和TNF-α水平明显升高(图5A),提示敏感小鼠胶质瘤诱导的免疫抑制被逆转。为了进一步证实推测,在第21天采用免疫组织化学方法评估巨噬细胞(F4/80)和细胞毒性T淋巴细胞(CD8α)的浸润程度。虽然对照组小鼠和模型小鼠之间没有明显变化(图5B),但TMZ敏感小鼠的大脑和肿瘤组织中巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞的百分比明显更高(图5C),TMZ敏感人群的免疫浸润增加。


    

图5 TMZ敏感小鼠和非敏感小鼠的不同免疫浸润。A.S和NS小鼠血清中IL-1β和TNF-α的水平。对照组、模型组(B)、S和NS组(C)小鼠CD8α、F4/80免疫组化及定量。


5. ABX给药限制了TMZ的疗效和免疫细胞的招募

在确认TMZ敏感和非敏感小鼠肠道微生物群结构和免疫浸润的差异后,我们希望进一步研究肠道微生物群在个体化TMZ敏感性中作用。使用广谱抗生素混合物(ABX)来根除携带肿瘤的小鼠的肠道微生物群(图6A),并且如预期的那样,ABX处理导致小鼠体重进一步降低(图6B)。随后对具有/不具有肠道菌群的TMZ的抗肿瘤作用评估显示ABX略微促进了胶质瘤的发展(p>0.05),而显着减弱了TMZ的功效(p<0.05)(图6C,D)。同时,肠道微生物群缺失后,肿瘤的侵袭能力和Ki67水平明显升高(图6E)。这些结果证实了肠道细菌参与胶质瘤的发展和TMZ抗胶质瘤的功效。


    

图6 广谱抗生素治疗对TMZ疗效的影响。A.ABX处理实验流程。B.TMZ和ABX给药对小鼠体重的影响。C.各组小鼠总通量。D.相对总通量(Flux第14天/ Flux第7天)评价化疗效果。E.不同组小鼠代表性照片、HE染色和免疫组化(Ki67)


免疫组化显示ABX后小鼠脑和肿瘤组织中巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞的招募减少(TMZ vs ABX-TMZ) (图7A)。来自流式细胞术分析的结果表明TMZ处理后巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞在脑中的募集增加(ModelvsTMZ) ,而ABX联合TMZ处理后巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞水平降低(ABX-ModelvsABX-TMZ),这些表明肠道微生物群确实通过免疫调节介导TMZ功效(图7B)。综上所述,结合代谢组学的微生物学研究证实,在胶质瘤原位异种移植模型中,肠道微生物群可通过免疫调节影响TMZ的个体化疗效。


    

图7 广谱抗菌素对荷瘤小鼠免疫浸润的影响。小鼠的免疫组织化学(A)和流式细胞术分析(B)


实验结论

总之,该研究确定了肠道微生物群在TMZ抗癌作用中的关键作用。特别是TMZ敏感个体和非敏感个体的肠道菌群分布和免疫浸润存在差异。此外,ABX治疗加速了胶质瘤的发展,逆转了TMZ的抗肿瘤作用,加重了癌症诱发的免疫抑制。这项研究揭示了肠道微生物群通过免疫调节参与个体化TMZ疗效,因此肠道微生物群可作为胶质瘤治疗的预测性生物标志物或治疗靶点。阐明肠道微生物群及其代谢物各自的作用,可能为替莫唑胺在神经胶质瘤治疗中的精准医学干预提供机会。


    

图8 肠道菌群通过免疫调节介导个体化TMZ疗效的示意图


科研拓展

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