文献解读 | IF =30.1! Mas激活通过增强脂噬和FAO来缓解APAP诱导的小鼠肝毒性

●期刊：Journal of Hepatology

●发表时间：2023.03

●影响因子：30.1分

自噬指细胞吞噬和降解受损的细胞器和细胞质的过程。脂噬是一种特殊的自噬，它能降解脂肪并释放游离脂肪酸，为FAO提供底物。在APAP诱导的肝毒性中，自噬可通过清除受损的线粒体和APAP加合物，减少活性氧的产生，而FAO可预防脂毒性的危害。因此增强自噬和FAO对APAP诱导的肝毒性具有有益作用。相关文献报道，Mas同时参与自噬与脂代谢，但Mas在DILI中的作用尚待研究。本文发现激活Mas增强了AKT-FOXO1依赖型脂噬和FAO，缓解小鼠APAP诱导的肝毒性。这表明Mas可能是DILI的一种新的治疗靶点。

✦Mas在DILI过程中发挥重要作用：DILI人和小鼠中Mas表达量上升，且Mas缺失会加重小鼠的肝损伤；

✦Mas可通过调控脂噬和FAO影响小鼠肝毒性：Mas缺失使得自噬受损和减弱FAO，从而加重DILI小鼠肝损伤；Mas激活可增强脂噬和FAO，从而缓解DILI小鼠的肝损伤。

✦FOXO1为AKT的下游信号通路，二者为脂噬和FAO的上游通路，FAO在脂噬的下游发挥作用：激活Mas可抑制AKT信号通路，激活FOXO1信号通路，增强脂噬而产生更多的脂肪酸，脂肪酸作为底物来增强下游的FAO，从而缓解DILI小鼠肝损伤（图片摘要如下）。

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图1 | Mas在DILI人和小鼠中的表达。(A) HC组和DILI组(n = 10)人肝脏切片的IHC染色图。(B) HC组和DILI组人肝脏切片中各种细胞的mIHC染色图。(C-D)不同剂量APAP处理的WT小鼠肝脏切片中Mas的IHC染色图和小鼠肝内Mas1的mRNA水平。(E)不同剂量APAP处理的WT小鼠肝脏切片中Mas在各细胞的mIHC染色图。HNF4α，肝细胞；α-SMA+，造血干细胞；CD31+，内皮细胞；CD68+CD14-，巨噬细胞；CD16+CD68-CD14-，中性粒细胞；CD16+CD68+CD14+，单核细胞。

作者首先比较DILI病人（DILI组）和健康人（HC组）中Mas含量，发现在肝组织（图1A）和部分细胞（图1B）中，DILI组中Mas的含量均上升。接着，作者用不同剂量的APAP刺激小鼠构建DILI小鼠模型，发现Mas的蛋白表达量与APAP呈剂量依赖性（图1C），且Mas的mRNA水平量也在APAP刺激组中增多（图1D）。这一现象也在DILI小鼠多种细胞中得到证实（图1E）。作者得出结论，Mas在DILI的进程中发挥重要作用。

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图2 | Mas1敲除加重APAP诱导的小鼠肝毒性。APAP处理小鼠24h(n = 6/组)。(A)各组的肝脏代表性图片、HE染色、Tunel染色、F4/80（巨噬细胞）和MPO（中性粒细胞）。（B）血清ALT浓度。（C）用致死量APAP（650mg/kg）处理后，两组小鼠的生存曲线。（D）WB检测一些炎症因子。（E）热图显示与细胞凋亡、坏死、铁死亡和炎症因子相关基因的表达。（F）DAOSLIMIT对活小鼠肝脏血管(WGA)中Ly6G和F4/80的最大强度投影。

为了探究Mas在体内的作用，作者首先对Mas基因敲除（Mas1^-/-）和野生型（WT）的小鼠进行APAP处理。结果表明Mas1^-1-小鼠对APAP表现出严重的不耐受，具体表现为：Mas1^-/-小鼠炎症细胞浸润更多、坏死肝细胞更多（图2A）、血清ALP含量更多（图2B）、生存率更低（图2C）以及炎症因子表达量更高（图2D）。转录组结果表明，与细胞凋亡、坏死、铁死亡和炎症因子相关基因在Mas1^-/-组小鼠中的表达量更高（图2E）。Mas1^-/-小鼠肝内中性粒细胞和巨噬细胞的含量更多（图2F）。这说明在体内Mas缺失会加重APAP诱导的肝损伤。

图3 | 在APAP 诱导的小鼠肝毒性中，Mas1缺失扰动脂噬和FAO相关通路。(A)使用蛋白质组学和RNA-seq数据生成的Spearman相关对(p <0.05)进行进一步的聚类分析。（B-C）在WT-APAP和Mas1^-/--APAP组中，得到的差异表达基因（B）和差异代谢物（C）的KEGG图。（D）热图各组中部分基因的表达量。（E）WB检测部分蛋白的表达量。(F-G)肝组织的电镜图（F）及自噬小体的数目（G）。（H-K）肝内BODIPY/LAMP1和BODIPY/ATGL共染色(H)，LDs (bodipy阳性点)的定量(I)和共定位(J)。(K)肝中TG的含量。AVs，自噬小体；BODIPY/LAMP1，脂噬标记物；BODIPY/ATGL，脂解标记物。

确定Mas在小鼠体内的作用后，随后作者通过转录组、蛋白组和代谢组检测探究了Mas的作用机制。根据图3A-3D的结果，作者猜测Mas主要是通过AKT-FOXO1轴影响自噬和FAO，从而在肝损伤进程中发挥作用。为了验证这一猜测，作者实施了一系列的实验。WB结果表明，Mas1^-/--APAP小鼠自噬受损（LC3-II、ATG7和LAMP1减少，P62累积），脂肪分解（ATGL减少），减弱FAO（ACOX1和CPT1A降低），AKT通路激活（AKT和p-AKT升高），FOXO1通路被抑制（FOXO1和ac-FOXO1降低）（图3E），Mas1^-/--APAP组小鼠自噬小体的数量明显减少（图3F-3G）。Mas1^-/--APAP组小鼠脂噬(BODIPY/LAMP1共定位)和脂解(BODIPY/ATGL共定位)减少（图3H-3J），且肝脏中甘油三酯（TG）减少（图3K）。终上所述，作者发现敲降Mas通过AKT-FOXO1轴使得自噬受损和减弱FAO，从加重APAP诱导的小鼠肝损伤。

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图4 | Mas激活可通过增强脂噬和FAO缓解APAP诱导的小鼠肝损伤。（A）两组小鼠的肝脏代表性图片、HE染色、Tunel染色、F4/80（巨噬细胞）和MPO（中性粒细胞）。（B）血清ALT含量。（C）两组小鼠的生存曲线。（D，H）WB检测部分蛋白的表达量。（E）中性粒细胞的数量和迁移速度图。（F）肝脏电子电子显微镜图和AVs的数目。（G）BODIPY/LAMP1代表性共染图及定量图。（I）热图显示脂肪酸降解、自噬和脂滴形成途径(RNA-seq)中基因的表达量。（J）代谢组检测得到的差异代谢物热图。(K-L)靶向脂质组得到的差异脂质热图。（M）跟踪给药示意图。（O-P）失踪法测定FAO的中间产物（O）及相关酶（P）的肝内丰度。AVE0991，Mas的激活剂；AVs，自噬小体。C16，棕榈酰肉碱；C14，肉豆蔻酰肉碱；C12，月桂酰肉碱。

此外，作者还发现给WT-APAP小鼠使用AVE0991（Mas激活剂）之后，小鼠的肝损伤症状得到缓解（图4A-4B），存活率得到提升（图4C），肝内炎症、线粒体应急等得到缓解（图4D），中粒细胞浸润现象的得到缓解（图4E），肝内脂肪吞噬、FAO和脂噬（图4F-4H）也得到缓解。KEGG结果表明，AVE0991增强了脂肪酸降解和自噬途径，抑制了LD形成途径（图4I）。代谢组结果表明AVE0991可显著增加单腺甘油（TAG的产物）和磷脂酰乙醇胺（与自噬体密切相关的代谢物）（图4J）。上述结论进一步被靶向代谢组的结果验证（图4K-4L）。为了获取AVE0991可调控FAO的更直接证据，作者做了同位素标记示踪实验。图4N-4P表明，AVE0991显著增加了FAO部分中间产物和相关酶的丰度，说明AVE0991显著增加了脂肪酸的体内周转。以上证据表明，Mas激活是通过增加脂噬和FAO来缓解APAP诱导的小鼠肝毒性。

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图5 | 脂噬和FAO是Mas缓解APAP诱导小鼠肝毒性的关键下游参与者。(A,G,I,L)肝脏HE染色结果。(B, J)血清ALT和肝脏TG水平。(C, F)WB检测部分蛋白的表达量。(D)自噬小体电子显微图。(E,K) BODIPY/LAMP1代表性共染图及定量图。(H)小鼠给药示意图。

为了进一步探究脂噬和FAO在APAP小鼠Mas信号中的作用，作者分别对WT-APAP小鼠给予RAPA（自噬诱导剂），CQ（自噬拮抗剂），非诺贝特（PPARα激动剂，促进FAO）和lanifibranor (泛PPAR激动剂，促进FAO)。结果显示，三种促进自噬或FAO的药物（RAPA、非诺贝特和lanifibranor）显著减轻了APAP诱导的肝损伤（图5A），且给药显著增强了肝内脂噬和FAO相关蛋白的表达(图5C，5F)，使得自噬小体数量增加(图5D)，导致TG、ALT(图5B)和LDs(图5E)减少。在确定自噬和FAO均能减轻肝损伤后，作者又探究了脂噬和FAO的上下游效应关系。而PPARα（抑制FAO）则会消除RAPA（促进自噬）对小鼠肝脏的保护作用（图5G），这说明FAO在脂噬的下游发挥作用。作者通过挽救实验发现CQ（抑制自噬）给药大大降低了AVE09911（Mas激动剂）的保护作用，而非诺贝特（促进FAO）大大逆转了CQ的有害作用（图5I-5J）。TG和ALT含量（图5J）和脂噬标志物的含量（图5K）也呈现相同的趋势。此外，作者发现PPARα敲除可逆转AVE09911产生的保护作用（图5L）。综上所述，激活Mas信号通路，脂噬产生的脂肪酸增多，脂肪酸可作为底物来增强下游的FAO，从而缓解APAP造成的肝损伤。   

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图6 | AKT和FOXO1是Mas调控的下游通路。(A, D, G)肝脏HE染色结果。（B，E，H）WB检测部分蛋白的表达量。(C, F, I)肝脏中部分mRNA表达。(J) BODIPY/LAMP1代表性共染图及定量图。

前面基础实验和组学实验表明，Mas敲除，AKT通路被激活，FOXO1通路被抑制。但是二者具体的上下游效应关系尚待探讨。相关研究表明，FOXO1可负调控PI3K-AKT信号通路来增强自噬。为了更深入探究Mas的调控机制，作者通过perifosine(p-AKT的抑制剂)、AS1842856(FOXO1的抑制剂)和sirtinol(去乙酰化酶的抑制剂，可促进FAO，因FAO过程需要乙酰转移酶的参与)来确定AKT和FOXO1的作用。在Mas1^-/-APAP小鼠中，perifosine显著降低肝损伤和TG浓度（图6A），增加了FOXO1总蛋白表达，自噬、脂肪分解和FAO得到增强(图6B-6C)，表明抑制AKT信号通路可增强脂噬和FAO，且AKT信号通路在FOXO1通路的上游。在WT-APAP小鼠中，AS1842856显著降低了AVE0991（Mas激活剂）的作用，并抑制了自噬、脂肪分解和FAO(图6D-F)，说明抑制FOXO1能抑制脂噬和FAO，且FOXO1信号通路是Mas的下游作用通路。相比之下，sirtinol显著逆转了Mas1^-/--APAP小鼠的疾病表型，使得FOXO1蛋白水平增加，自噬、脂肪分解和FAO增强(图6G-I)。此外，sirtinol对脂噬的增强作用也通过BODIPY/LAMP1共定位得到证实(图6J)。因此，激活Mas可抑制AKT信号通路，激活FOXO1信号通路，增强脂噬，增强FAO，从而缓解DILI小鼠肝损伤。

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图7 | 肝内和肝细胞Mas缺失会加重APAP诱导的小鼠肝毒性。（A，F，J）肝脏HE染色结果。（B）血清ALT和肝脏TG水平。（C，G）欧联蛋白mRNA水平。（D，H，K）WB检测部分蛋白的表达量。（E，I，L）BODIPY/LAMP1代表性共染图及定量图。

作者分别敲降小鼠肝脏的Mas（WT-sh-Mas）和肝细胞特异性的Mas（Alb^creMas1^f/f）。与各自的对照组相比，WT-sh-Mas（图7A-7E）和Alb^creMas^f/f（图7F-7I）小鼠的肝毒性加重，自噬、脂解和FAO加重。随后，作者发现在APAP处理2h后，AVE0991给药依然可以恢复由APAP诱导的肝损伤（图7J-7L）。但是APAP处理24h和48h后，AVE0991给药不能恢复小鼠的肝损伤（data not shown）。上述证据表明，Mas缺失可加重小鼠APAP诱导的肝损伤，Mas的激活剂—AVE0991对APAP伤害2h以内的小鼠具有较好的治疗效果。

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图7 | Mas通过AKT-和FOXO1-依赖性通路在APAP处理的人和小鼠肝细胞中调节脂噬和FAO。(A, J,Q,T)WB检测部分蛋白的表达量。(B)自噬示意图。(C, K)自噬通量的代表性共染图及定量，黄色表示自噬小体，红色表示自溶小体。(D, L) BODIPY/LAMP1代表性共染图及定量。（E）线粒体FAO示意图。(F, M)代谢通量热图。(G, N) 13c标记的酰基肉碱和酰基辅酶a的丰度。(H, O, R, U) FL-C16/Mito的代表性共染图及定量。(I, P, S, V)基础和最大OCR值。A-P用的是小鼠肝细胞，Q-V用的是人源肝细胞。

作者先在体外用siRNA分别敲除了AKT和FOXO1基因，图8A-8I以及图8J-8P证明了敲降效果。在APAP处理后Mas敲降小鼠中，siAKT可降低一些蛋白的表达量（图8A），且自噬小体和自溶小体增多（图8B-8C），FAO过程中间产物增多（图8E-8F），运输到线粒体中的脂肪酸（图8H）和耗氧量（图8I）增多，表明敲降AKT能增强自噬、脂噬和FAO，且能激活FOXO1信号通路。在APAP处理后再给药AVE0991小鼠中，敲降FOXO1观察到相反的现象（图8J-8O），表明敲降FOXO1会降低自噬、脂噬和FAO。上述结论也在人源的肝细胞中得到验证（图8Q-8V）。综上所述，作者认为Mas激活可通过抑制AKT信号通路，激活FOXO1信号通路，增强脂噬和FAO，从而缓解APAP诱导的小鼠肝毒性。

作者发现Mas激活可通过抑制AKT信号通路，激活FOXO1信号通路，增强脂噬和FAO，从而缓解APAP诱导的小鼠肝毒性。这表明Mas可能是DILI的一个新的治疗靶点。

本文采用了转录组测序、蛋白组测序、代谢组测序和靶向代谢组学四种高通量检测技术。其中靶向代谢组学，是针对特定某一物质或某一类代谢物进行检测的代谢组学方法，以标准品为参照，利用多反应监测(MRM)技术对目标代谢物进行准确的定性定量分析。靶向代谢组学具有特异性强，灵敏度高和定量准确等特点。