通过高分辨质谱结合NMR和氢/氘交换实验研究Nirmatrelvir分析样品溶液中的差向异构体杂质

ACD/Labs

通过高分辨质谱结合NMR和氢/氘交换实验研究Nirmatrelvir分析样品溶液中的差向异构体杂质

摘要

在 Nirmatrelvir有关物质检测过程中观察到一个未知峰，该未知峰会在样品溶液贮存过程中，随着时间而增长。通过使用包括LC-PDA/UV-MSn在内的分析研究策略，该未知峰被迅速鉴定为Nirmatrelvir的差向异构体，这是一种溶液降解产物，由玻璃 HPLC 小瓶中浸出的痕量碱性杂质引起。此外，通过使用氢/氘交换核磁共振光谱分析，差向异构化位置被确定为与氰基相邻的α碳上。进一步的研究表明，当使用塑料 HPLC 或质谱级小瓶代替玻璃 HPLC 小瓶时，可以抑制该降解物的产生。

引言

Nirmatrelvir，化学名称为 (1R,2S,5S)-N-((S)-1-cyano-2-((S)- 2-oxopyrro-lidin-3-yl)ethyl)-3-((S) -3,3-dimethyl-2-(2,2,2 tri fluoroacetamido)butanoyl)-6,6-dimethyl-3-azabicyclo[3.1.0]hexane-2-carboxamide，是一种新型的口服生物蛋白抑制剂，可抑制SARS-CoV-2的主要蛋白酶—3CL蛋白酶，SARS-CoV-2 是导致 COVID-19 大流行的病毒。根据一项大型 2/3 期试验，使用实验性药物 PAXLOVID药物进行治疗，该药物包含 Nirmatrelvir 和作为药代动力学增强剂的利托那韦，显示COVID-19 患者的住院或死亡风险降低了89%。基于临床数据和对持续大流行的考虑，美国食品和药物管理局（FDA）于2021年12月22日授权紧急使用PAXLOVID对治疗COVID-19患者。在紧急授权之前，PAXLOVID之的开发商辉瑞公司与联合国组织药品专利池（MPP）签署了许可协议，以扩大PAXLOVID，在低收入和中等收入国家的使用。作为 MPP 的次级被许单位之一，华海药物着手开发该药物的仿制药。

在Nirmatrelvir的有关物质检测过程中，在 26.0 分钟（相对保留时间RRT = 0.99）处观察到一个未知峰。结果发现，在最初的同一批次的Nirmatrelvir API 中，该未知峰的含量可以在 0.02% 到 0.10% 之间变化，其具体取决于用于样品进样的玻璃 HPLC 小瓶的类型。同时 随着时间的推移，这个未知峰会在 14 小时内达到约 0.2%。然而，当使用塑料 HPLC 或质谱级小瓶代替玻璃 HPLC 小瓶时，就不会出现这种现象。我们认为，Nirmatrelvir 样品溶液中 RRT 0.99 杂质的产生很可能是由于玻璃 HPLC 小瓶中的可浸出碱性杂质引起的，有文献曾经报道过类似的浸出物引起降解杂质的案例。由于这类降解杂质的含量经常超过 ICH 规定的阈值，因此需要调查其结构和根本原因。在我们的实验室中，LC-PDA/UV-MSn 和 NMR光谱技术结合强降机理研究策略已被证明是快速阐明未知降解产物的结构和形成机制的非常有效的手段，于是该策略再次用于研究这种未知的溶液降解物。

在本文中，我们报告了鉴定降解物结构的过程，该降解物最初是在 HPLC 分析期间在 RRT 0.99 下观察到的，并提出了其形成机制。通过 LC-PDA/UV-MSn 分析结合 1D 和 2D NMR 光谱学以及氢/氘交换实验，最终确定 RRT 0.99 未知降解物是 Nirmatrelvir 的差向异构体。

实验

有关物质HPLC-UV/DAD方法

色谱柱：Agilent SB-Phenyl RRHD(150 × 2.1 mm, 1.8 µm)

流动相A：0.1%甲磺酸水溶液

流动相B：乙腈

柱温：75℃

流速：0.475mL/min

梯度程序：

LC-PDA/UV-MSn方法：

仪器：Agilent 1260加6545系列Q-TOF MS检测器

液相方法参数同上，用TFA代替甲磺酸。

Q-TOF参数：

nebulizer pressure ：60 psi,

drying gas flow ：10 L/min,

drying gas temperature ：325 ℃,

sheath gas temperature ：350 ℃,

sheath gas flow ：12 L/min，

capillary voltage：4.0 kV.，

mass acquisition range m/z：50–1000.

二级MS谱图采集时的撞击能量分别设为：10, 20, 30和 50 eV。

酸性和碱性条件下的强降研究

酸强降条件：20mL 0.22mmol的API溶液(乙腈：水=1：1)加入20mL 0.1N的HCl溶液，60℃下振摇2天。

碱强降条件：20mL 0.22mmol的API溶液(乙腈：水=1：1)加入20mL 0.02N的NaOH溶液，25℃下振摇4h。

制备分离RRT0.99的杂质

为了分离出足够量的RRT0.99的杂质用于NMR研究，在碱性条件下对样品进行强制降解。20mL 1.1mmol的API溶液(乙腈：水=1：1)加入20mL 0.02N的NaOH溶液，25℃下振摇24h。能够达到34%的收率，接近于理论上最大50%的收率。在岛津制备色谱上收集分离出240mg RRT0.99杂质和Nirmatrelvir（比率大约1：1）的固体混合物。

氢/氘交换研究

基于碱性条件下的强降实验设计了氢/氘交换研究。220mg的API溶液(30mL 乙腈：氘水=1：1)加入43mg的NaOH溶液，25℃下振摇12h。得到的溶液通过LC-PDA/UV-MSn进行分析，并通过上述的制备方式得到氘代的RRT 0.99 杂质和氘化 nirmatrelvir。

1D 和2DNMR

将约 20 mg 的含有 RRT 0.99 杂质的上述混合物溶解在 1 mL DMSO-d6 中。在Agilent 400 MHz核磁仪上采集1H、13C 和gCOSY、gHSQC 和 gHMBC  2D NMR谱图，并采集了Nirmatrelvir的相应NMR谱。

结果与讨论

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LC-PDA/UV-MSn数据分析

未知峰最初是在Nirmatrelvir的有关物质检测方法（25.960 min）（图 1a）观察到的，其相对保留时间（RRT）为 0.99。RRT 0.99杂质的紫外光谱与Nirmatrelvir相同，表明RRT 0.99杂质与Nirmatrelvir具有相同或相似的发色团。通过收集有关物质方法下未知峰的初始部分（图 S1b）获得纯 RRT 0.99 杂质样品，并将收集的馏分进行 LC-MS/MS 分析。  RRT 0.99 杂质的准确的m/z 值为 500.2484，表明该杂质是 Nirmatrelvir 的差向异构体（理论 m/z 值：500.2479）。RRT 0.99 杂质 (m/z 500.2492) 的 MS/MS 谱图如图 1b 所示，与Nirmatrelvir的谱图基本相同（图 1c）

根据上述UV和MS分析结果，可以合理推测RRT 0.99杂质是Nirmatrelvir的差向异构体之一。充分考虑Nirmatrelvir的结构，我们推断氰基 (C-6) 的碳 碳C应该是差向异构化的位点，这是由于吸电子氰基对 H-6 的活化。活化会使 H-6 酸性更强，因此，它可能会被从 HPLC 小瓶中浸出的碱性杂质去质子化，从而在 C-6 位点引发碱催化的差向异构化。

2

酸性和碱性条件下的强制降解研究，以及RRT 0.99杂质的制备

从以上LC-PDA/UV-MSn结果，我们推测了RRT 0.99杂质的可能结构及其形成机制。为了验证其结构和提出的形成机制，我们设计了一项强降研究，其中分别使用酸 (HCl) 或碱 (NaOH) 处理 Nirmatrelvir。结果发现，在 0.02 N NaOH 水溶液中，在 25 ，在下放置 4 小时，观察到 RRT 0.99 杂质含量为 4.28%，24 小时后其含量增加到 34%。一方面，在 0.1 N HCl 的酸性强制降解条件下，60 强制降解条件，RRT 0.99 杂质才有 3.65%。很明显，Nirmatrelvir在碱性条件下比在酸性条件下更容易降解，导致形成 RRT 0.99 杂质。上述强降研究提供了进一步的证据来支持在有关物质检测过程中观察到的溶液降解是由于碱催化差向异构化的假设。值得注意的是，在其他强制降解条件下没有观察到差向异构化。

为了进一步证实 C-6 上发生了差向异构化，有必要分离出足以进行 NMR 表征的 RRT 0.99 杂质。然而，考虑到Nirmatrelvir和 RRT 0.99 杂质之间的色谱分离度较差，这可能会阻碍 RRT 0.99 杂质的分离制备，因此获得足够量的纯 RRT 0.99 杂质将非常耗时。因此，决定制备得到 RRT 0.99 杂质和 Nirmatrelvir 的混合物，其中两种异构体的存在量相当。这种混合物通过制备型反相液相色谱仪可以快速获得，获得的量足以用于后续的核磁共振研究，包括各种一维和二维核磁共振实验，以确认差向异构化位点。

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RRT 0.99 杂质的一维和二维核磁共振表征

Nirmatrelvir和RRT 0.99 杂质分离混合物（含有Nirmatrelvir和富集的 RRT 0.99 杂质）的所有 1H 和 13C NMR 数据总结在表 1 中。其中Nirmatrelvir API 的 1H 和 13C 化学位移与报道的一致。通过仔细比较上述 1H 和 13C NMR 数据，可以确定RRT 0.99 杂质的特征 NMR 信号（表 1）。在Nirmatrelvir和 RRT 0.99 杂质之间的特征 NMR 信号中，除了 H-6 信号外，所有信号类型都非常相似。H-5、H-5''、H-6 和 H-24 的耦合信号在 Nirmatrelvir 和 RRT 0.99 杂质中均构成 ABMX 系统（图 2），其中 H-5 和 H-5'' 代表 A 和 B、H-6代表 M ， H-24 代表 X。在分离混合物的 COSY 光谱中证明了 H-6 与 H-5、H-5'' 和 H-24 的相关性（图 S2）。在Nirmatrelvir 中，ABMX 系统的 M 信号（即 H-6）表现为近似的三重双峰（ddd）（图 3），根据 ACD 软件计算，其各自的耦合常数分别为 10.66、8.51 和 5.09 Hz。然而，在 RRT 0.99 杂质中，由于 H-6 的反转，H-5/H-6、H-5''/H-6 和 H-24/H-6 之间的耦合常数恰好变得非常相似 ，这使得 ABMX 系统的 M 信号接近四重峰（图 3），耦合常数为 7.04 Hz。根据以上结果和分析，确认差向异构化发生在C-6位，即氰基的α位。

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氢/氘交换核磁共振研究

根据上述LC-PDA/UV-MSn和NMR结果，我们提出了RRT 0.99杂质的结构和形成机制。为了进一步验证该机理，在碱性强降研究的基础上设计了氢/氘交换研究，其中乙腈/H2O溶液被乙腈/D2O替代。

在上述氢/氘交换实验溶液的 LC-MS 研究中，可以观察到其单氘化的 d-RRT 0.99 杂质（氘化杂质）和 d-nirmatrelvir（图 S2）。此外，在分离的 d-RRT 0.99 杂质的 NMR 研究中，由于在氢/氘交换研究中 H-6 被 D-6 取代，H-6 信号消失了（图 4）。通过上述氢/氘交换研究，为以下假设提供了令人信服的证据，导致 RRT 0.99 杂质形成的原因是由于碱催化下的C-6 位置上H-6 反转的差向异构化（Scheme 1）。在辉瑞的药物设计阶段，选择Nirmatrelvir作为最终候选结构至少或部分是基于以下发现：Nirmatrelvir 的差向异构化明显少于其备选结构（该备选结构包含一个芳香羰基（Nirmatrelvir 中氰基对应位置）在C- 6的α位）。然而，我们目前的研究表明，Nirmatrelvir在碱性条件下仍然在某种程度上容易发生差向异构化。

结论

在Nirmatrelvir的有关物质检测过程中发生了Nirmatrelvir分析样品的溶液降解反应。通过使用 LC-UV/PDA-MSn 研究策略，这种未知的降解物很快被确定为 Nirmatrelvir 的差向异构体之一。碱性条件下的强降研究结果表明其可能的根本原因是由于玻璃 HPLC 小瓶中可浸出的碱性杂质引起的碱催化差向异构化；在过往的文献中也报告了由于玻璃瓶浸出物导致的化合物在溶液状态下的降解，其中包括中性，碱性溶液中的差向异构化。此外，通过氢/氘交换核磁共振研究，差向异构化的位置被证实为在C-6，即在氰基的α位。该研究的发现有助于帮助其他药物分析研究中的类似性质的未知峰调查研究，并且在药物化学家设计和选择潜在差向异构化的未来候选药物的时候也可能具有一定的价值。

华海郑乐伟博士的Comments

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精

一个最好的例子就是在这篇文章中，H-6的峰型判断上。我们一开始只是简单的认为在奈马特韦中H-6是一个八重峰，杂质中是四重峰，导致此变化的原因是由于H反转后二面角的变化使其中一个J（耦合常数）趋近于0。但是后来发现其实软件在对氢进行积分的时候已经将峰型进行了计算，看起来的八重峰其实是一个ddd峰，四重峰本质上其实也是一个ddd峰，只是由于三个耦合常数趋于接近表观上看起来是一个四重峰。

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