IF=34.91∣中国人民解放军陆军特色医学中心发现周细胞协同改善脓毒症后血管低反应性和血管渗漏的机制

2023年3月13号，陆军特色医学中心刘良明和李涛教授团队在国际期刊Military Medical Research（IF=34.91）上发表了题为《Pericytes protect rats and mice from sepsis-induced injuries by maintaining vascular reactivity and barrier function: implication of miRNAs and microvesicles》的文章。本文发现，周细胞的脱落会加重脓毒症血管低反应性和血管渗漏，输注周细胞可协同改善脓毒症血管反应性和血管通透性，功能增强的周细胞效果更好。机制研究主要是周细胞通过分泌携带miR-145和miR-132的微囊泡来发挥协同保护作用，其中miR-145主要在血管平滑肌细胞中起作用，它主要是通过降低Sphk2和S1PR1的表达，增加p-MLC₂₀的表达来发挥作用；miR-132主要在血管内皮细胞中起作用，它主要是通过降低Sphk2和S1PR2的表达，增加ZO-1和VE-cadherin的表达来发挥作用。

脓毒症是针对感染失调的宿主反应引起的危及生命的器官功能障碍。它是临床ICU中常见的危重病症，其发生率和死亡率均很高。脓毒症和脓毒性休克的后期会出现血管功能障碍，即血管低反应性和血管渗漏的病理生理过程，最终导致多器官功能衰竭。因此，寻找预防和治疗脓毒症致血管功能障碍的措施，对降低脓毒症的发生率和死亡率具有重要意义。目前，临床上针对脓毒症后血管低反应性和血管渗漏的发生机制，提出了一系列的防治措施，但这些措施在纠正血管低反应性和血管渗漏过程中存在矛盾现象，如针对血管低反应性，临床上通常会使用缩血管药物去甲肾上腺素（NE）或精氨酸血管加压素（AVP）），但这些药物在改善血管反应性的同时，会增加血管内皮细胞（VEC）骨架蛋白收缩，加重血管渗漏。目前临床上尚无协同解决血管低反应性和血管渗漏的措施。

周细胞定位在微血管壁外侧，是微血管的重要组成细胞之一，它在微血管的形成及局部血流调节中发挥重要作用。以往的研究发现，周细胞主要调控内皮屏障的功能。体内实验证实，周细胞的减少与内皮屏障的破坏息息相关；体外实验也证实，周细胞和内皮细胞共培养的模型比单独培养的内皮具有更高的屏障功能。因此，研究血管低反应性与血管渗漏的枢纽调控机制，寻找协同防治措施，对解决脓毒症等临床重症血管低反应性和血管渗漏问题，提高临床重症的治疗效果具有重要意义。

经过团队多年的科学研究，提出了以下三个研究目的：（1）明确脓毒症后周细胞结构的变化与血管反应性和血管通透性的关系；（2）探究外源性周细胞对脓毒症血管反应性和血管通透性协同改善作用及其机制；（3）为严重脓毒症或者脓毒性休克患者血管功能障碍，尤其是血管低反应性和血管渗漏治疗时出现的矛盾现象提供了新的方向。

免疫荧光结果发现，CLP及LPS后血管周细胞数量下降、结构破坏，表现为肠系膜微血管PDGFR-β和NG-2的表达逐渐降低；LPS组术后24h，周细胞数量变化趋势与CLP组相似。脓毒症后肠系膜微血管PDGFR-β和NG-2蛋白表达也逐渐降低。肠系膜微血管超微结构显示，正常情况下，肠系膜微血管周细胞紧紧围绕内皮细胞外侧，同时，可见周细胞与血管内皮细胞形成peg-socket盒，脓毒症后肠系膜微血管周细胞明显脱落及肿胀、结构破坏，并伴有红细胞渗出。视网膜血管超微结果显示，正常情况下可明显观察到视网膜周细胞与血管内皮细胞形成的Peg-Socket盒，而脓毒症组大鼠视网膜周细胞明显肿胀、空泡增加。

脓毒症后大鼠肠系膜微动脉舒缩反应性降低、肠系膜上动脉p-MLC₂₀表达降低。脓毒症后肠系膜微静脉及毛细血管网渗漏逐渐增加，具体表现为肠系膜微静脉和毛细血管网对FITC-BSA的透过率逐渐增加。内皮超微结果显示，假手术组可明显观察到肠系膜微血管内皮细胞的高密度紧密连接，而脓毒症大鼠内皮细胞肿胀、紧密连接明显开放、紧密连接连续性明显破坏，同样，视网膜血管超微结果也呈现相同的变化。免疫荧光和WB结果显示，脓毒症24h后，肠系膜微静脉内皮间ZO-1和VE-cadherin连续性破坏、表达降低。上述结果提示脓毒症后周细胞的脱落与血管低反应性和血管渗漏密切相关。 

以不同浓度的周细胞治疗脓毒症大鼠，结果发现脓毒症组大鼠存活率、存活时间很低，72h仅存活一只；常规治疗可部分改善脓毒症大鼠的存活率和存活时间，72h存活率和存活时间分别为18.75%（3/16）；周细胞（10⁶）治疗组，72h存活率和存活时间分别为50%（8/16），效果最好。同时发现输注周细胞可定植于脓毒症大鼠肠系膜微静脉上并参与血管内皮细胞的修复，并且在输注24h后定植最多。在输注后24h，肠系膜微血管NG-2和PDGFR-β的表达明显增加，而常规治疗后并没有明显的改善周细胞的数量。常规复苏可轻微改善脓毒症后血管低反应性和血管渗漏，而外源性周细胞输注后可明显改善血管反应性和血管屏障功能、血管内皮细胞结构和增加连接蛋白表达。提示外源性周细胞对脓毒症血管反应性和血管通透性具有协同保护作用。

采用腺病毒干扰周细胞中的Cx43，输注脓毒症动物中，结果发现，敲除Cx43的周细胞在脓毒症血管上的定植明显降低，对脓毒症血管反应性和血管通透性的改善作用也明显降低；进一步采用内皮Cx43敲除的基因鼠，与上述的结果一致。

通过透射电镜、扫描电镜和粒度径分析，发现周细胞可以产生MV，通过流式发现功能增强的周细胞可以产生更多的微囊泡。同时发现，PKH-26标记PCMV可以被VEC和VSMC所吸收，并随着时间的延长而增加。为研究PCMV对脓毒症后血管反应性和血管通透性的影响，分别从离体细胞水平和整体动物水平，观察PCMV对VSMC收缩功能和VEC屏障功能的影响。结果发现，PCMV可以明显改善脓毒症后血管低反应性和血管渗漏，其中功能增强的PCMV效果更好。

为了研究PCMV携带的miR-145/132对VSMC舒缩功能和VEC屏障功能的协同作用，通过抑制和高表达周细胞中的miR-145/132，制作高表达和低表达miR-145和miR-132的PCMV，作用于血管平滑肌细胞和血管内皮细胞，观察其对VSMC舒缩功能和VEC屏障功能的影响。

结果发现，LPS可降低血管平滑肌细胞的收缩反应性和p-MLC20的表达，PCMV可显著改善血管平滑肌细胞的舒缩功能。miR-145(-)PCMV降低PCMV对VSMC舒缩功能的改善作用，与PCMV组相比，miR-145(-)PCMV抑制了PCMV对VMSC收缩反应性的改善作用，miR-145(+)PCMV可增强PCMV对VSMC舒缩功能的改善作用；miR-132(+/-)PCMV对PCMV改善VSMC舒缩功能没有影响。LPS可破坏血管内皮细胞屏障功能，PCMV可显著改善血管内皮细胞屏障功能，miR-132(-)PCMV降低PCMV对VEC屏障功能的改善作用， miR-132(+)PCMV可增强PCMV对VEC屏障功能的保护作用；miR-145(+/-)PCMV对PCMV改善VEC屏障功能没有影响。进一步研究发现，LPS刺激后Sphk2的表达显着增加，而S1PR2和p-MLC20的表达显着降低。为了进一步阐明 Sphk2 在 VSMC 和 VEC 中的作用，将细胞中Sphk2均高表达，使用 S1PR1 抑制剂（W146）和 S1PR2 抑制剂（JTE013），结果发现，在平滑肌细胞中，Sphk2 的高表达拮抗了 PCMV 的保护作用，而抑制S1PR1可恢复对 VSMC的保护作用。在 内皮细胞中，Sphk2 的过表达会拮抗 PCMV 的保护作用，而 S1PR2 的抑制会恢复其内皮屏障保护作用。

本文研究发现，脓毒症后血管周细胞结构破坏、数量减少、覆盖率降低，在血管低反应性和血管渗漏中发挥重要作用；输注外源性的周细胞可协同改善脓毒症血管低反应性和血管渗漏。周细胞可以通过Cx43定植在血管上发挥协同保护作用，还可以通过分泌携带miR-145和miR-132的微囊泡分别作用于血管平滑肌细胞和血管内皮细胞，实现对脓毒症血管反应性和血管通透性的协同调控和保护作用，为临床治疗脓毒症患者时出现的矛盾现象，提供了新的方向。

本文中Cx43干扰腺病毒和阴性对照腺病毒均由上海吉凯基因提供，助力高水平的科学研究。

陆军特色医学中心刘良明和李涛教授为本文通讯作者，张紫森博士为第一作者。