甲流来袭，别怕！分子互作来解密

2023-03-10 05:18:30, 陈老湿德国赛多利斯集团

正值流感高发季节，近期全国各地均出现了不同程度的群体性感染。流感主要流行期为12月至次年3月，相较于普通感冒，流感的传染性更强，传播速度快，且症状更重，多伴有高热（≥38℃）、咽痛、咳嗽和肌肉酸痛等全身症状。季节性流行的流感多为甲型流感病毒中的H1N1和H3N2亚型，病毒颗粒呈球状，直径为80-120nm，囊膜上有许多突起糖蛋白，分别是血凝素HA、神经氨酸酶NA和M1/M2蛋白。

图1. 流感病毒结构图：外围标注的是结构蛋白，内部标注的是携带的非结构蛋白和结构蛋白的基因。

在甲流的基础研究以及药物研发方面，赛多利斯基于生物层干涉技术的Octet® 非标记分子互作仪拥有非常多CNS积累的案例，能够为科学研究提供新的洞察！

Octet® 在甲流侵染机制中的应用

流感病毒识别的是一类在动物细胞表面广泛存在的多糖，禽类受体是α2’3-唾液酸，而人类受体是α2’6-唾液酸，禽流感病毒能够感染人类，就是因为流感病毒表面蛋白发生了突变，其结合的受体从禽类受体向人受体转变导致。2013年，H7N9在中国华东地区爆发，掀起了流感病毒的研究的新一轮热潮。当年的一篇NATURE文章就用实例证明了Octet® 是检测流感病毒受体亲和力的神器^[1]。

之所以称为“神器”，因为这篇NATURE文献作者发现细胞表面的受体密度与固化在Octet® 的链霉亲和素传感器上的受体密度非常相似，所以是非常好的研究流感病毒与其受体亲和力的工具，而且可以直接将病毒而不是表面蛋白作为分析物。只需要将受体多糖在链霉亲和素传感器上固化成不同密度，结合同一浓度（100pM）的流感病毒，以固化密度（信号大小）和结合信号作图，就可以评估受体和病毒的结合活性。

图2. 曲线上升的越快，则说明亲和力越高。比如X-31型流感病毒,其对人受体的亲和力比禽类受体的要强。

作者说

由于多重结合等复杂因素，流感病毒颗粒结合受体后不能有效洗脱，固化受体的探测器表面的重生很难获得实现。生物层干涉（BLI）技术单个探针的成本相对较低，使得我们可以以较低成本广泛测试获得最优的检测条件，优化后的条件具有较高的实验重现度，可以实现横向对比不同毒株的结合能力。帮助我们在流感病毒的受体结合、抗体结合方面做出一系列的工作。

作者简介

熊晓犁博士
中科院广州生物医药与健康研究院研究员

2011年博士毕业于布里斯托大学细胞与分子医学系，博士毕业后师从皇家学会副会长流感病毒专家John Skehel爵士进行流感病毒的研究，运用X射线晶体学的方法率先解析了感染人类的禽流感毒株如H5N1，H7N9，H10N8的凝血素与受体形成的复合物的结构特征，并使用Biolayer Interferometry（生物层干涉）的方法测量了活病毒与人类和禽类受体分别的结合能力。作为第一作者，这一系列工作成果被Nature（3篇），PNAS（1篇），Virology （1篇），Virus Research（1篇）杂志分别发表。详细信息

这种方法最真实的反应出人体环境中的病毒结合能力，所以自从这种方法建立成功后，便得到了广泛的应用，多篇文献（含多篇CNS）也使用了这个方法来研究甲流病毒的进化^[2-8]。比如下面的一些发现：

图3.Octet® 数据发现2001年以来H3N2型流感对人受体亲和力在下降，可能与近10年来H3N2导致疾病的严重程度下降相关^[2]。

图4. Octet® 发现可以感染人类的H5型病毒完全去除了与禽受体的结合能力，保留了与人受体结合能力，H7型病毒对两者的结合能力相当。而H3型保留了两者的结合能力，对人受体结合更强^[3]。

Octet® 在药物研发领域中的应用（基于受体配体竞争实验）

研究机理的目的是应用，只要在前述方法基础上，在病毒中混入抑制剂，后与受体相互作用，便可通过竞争反应检测抑制剂的药效^[9-11]。

图5. Octet® 将多糖受体固化在传感器上，与小分子抑制剂和流感病毒的混合物反应发现，抑制剂可以部分阻断病毒和受体的结合^[11]。

图6. Octet® 发现抗体抑制剂FLD194可以阻断病毒与人受体和禽受体的结合^[12]。

固化了多糖受体的传感器还可以再生重复使用，达到降低使用成本的目的^[11]！

图7. 只要在病毒缓冲液中加入奥司他韦（OC），阻止病毒NA蛋白对多糖的剪切作用，就可以用酸性溶液洗掉病毒进行再生。

当然，还有很多使用Octet® 进行基于小分子药物^[13,14]、抗体药物^[15-20]和流感靶点亲和力测试的案例，这里就不一一列举了。

10年来，已经有近40篇使用Octet® 直接检测流感病毒与多糖受体亲和力的文献发表，并在此基础上，进行了药物的开发。真金不怕火炼，一次次的被选择真正说明Octet® 是检测流感病毒与其受体的神器！

最后提醒大家:

如果得了流感：需要多休息，多喝水，流感为自限性疾病，休息期间避免前往人员聚集的地方。如自觉症状有所加重，建议佩戴好口罩前往就近的发热门诊就诊，根据医嘱服用抗流感病毒药物。对于新冠的预防措施对于流感预防同样有效：勤洗手、正确洗手，做好手卫生。保持环境清洁和通风。保持良好的呼吸道卫生习惯，咳嗽或打喷嚏时，用上臂内侧或纸巾、毛巾等遮蔽住口鼻。重点人群建议每年接种流感疫苗。

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-参考文献-

[1]Receptor binding by a ferret-transmissible H5 avian influenza virus.nature,2013

[2]Evolution of the receptor binding properties of the influenza A(H3N2) hemagglutinin. www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1218841110

[3]Receptor binding by an H7N9 influenza virus from humans. doi:10.1038/nature12372

[4]Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses. Science. 2013 December 6; 342(6163): 1230–1235

[5]Recent evolution of equine influenza and the origin of canine influenza. www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1406606111

[6]Changes in the hemagglutinin of H5N1 viruses during human infection – Influence on receptor binding. Virology 447(2013)326–337

[7]Enhanced human receptor binding by H5 haemagglutinins. Virology456-457(2014)179–187

[8]Receptor binding by H10 influenza viruses. doi:10.1038/nature13443

[9]Biophysical Measurement of the Balance of Influenza A Hemagglutinin and Neuraminidase [10]Activities. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 290, NO. 10, pp. 6516–6521

[11]Preventing Influenza A Virus Infection by Mixed Inhibition of Neuraminidase and Hemagglutinin by Divalent Inhibitors. J. Med. Chem. 2022, 65, 7312−732

[12]Structures of complexes formed by H5 influenza hemagglutinin with a potent broadly neutralizing human monoclonal antibody。Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 July 28; 112(30): 9430–9435.

[13]Structure-based optimization and synthesis of antiviral drug Arbidol analogues with significantly improved affinity to influenza hemagglutinin. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2017

[14]A Potent Anti-influenza Compound Blocks Fusion through Stabilization of the Prefusion Conformation of the Hemagglutinin Protein. Infectious Diseases,2015

[15]A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.Science,2013

[16]Unique structural solution from a VH3-30 antibody targeting the hemagglutinin stem of influenza A viruses. NATURE COMMUNICATIONS | (2021) 12:559

[17]Influenza Infection in Humans Induces Broadly Cross-Reactive and Protective Neuraminidase- Reactive Antibodies. Cell

[18]Viral Receptor-Binding Site Antibodies with Diverse Germline.Cell

[19]A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen. SCIENCE,2015

[20]Optimization of affinity, specificity and function of designed influenza inhibitors using deep sequencing. nature biotechnology

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