项目文章 | 多组学分析揭示了鱼藤酮对蛹虫草深层发酵中虫草素产量的积极作用

2023-02-15 00:12:14, 欧易生物 上海欧易生物医学科技有限公司



2023年2月4日,中南林业科技大学刘高强课题组在Bioresource Technology杂志(IF:11.889)发表题为“Multi-omics analysis unravels positive effect of rotenone on the cordycepin biosynthesis in submerged fermentation of Cordyceps militaris”的研究论文,该研究报道了鱼藤酮对蛹虫草深层发酵过程中虫草素产量的影响,并通过多组学分析了鱼藤酮调控虫草素生物合成的相关机制,首次为虫草素在蛹虫草深层发酵中高效生产提供了添加鱼藤酮诱导剂的策略。



文章标题:Multi-omics analysis unravels positive effect of rotenone on the cordycepin biosynthesis in submerged fermentation of Cordyceps militaris

发表期刊:Bioresource Technology

影响因子:11.889

涉及的欧易生物服务产品:转录组测序、代谢组LC-MS


研究背景


蛹虫草 (Cordyceps militaris) 是一种虫生食药用菌,其代谢产物虫草素具有重要的药理价值。虫草素的生物合成及调控机制是研究的难点和热点。目前,优化光照、温度、培养基及添加诱导物等多种发酵策略已被报道用于提高虫草素产量,但虫草素在蛹虫草细胞中的合成量已接近瓶颈值。据研究报道,在厌氧菌或丝状真菌的发酵中已经证实甲基紫精或鱼藤酮等对次生代谢产物生物合成的积极作用。鱼藤酮是广谱杀虫剂,对害虫线粒体呼吸链表现出明显的抑制作用。前期分析表明,虫草素属于核苷类化合物,且其合成酶cns1为NAD(P)H依赖型氧化还原酶,因此,鱼藤酮可能具有通过调控蛹虫草胞内核苷酸代谢或能量代谢等来提高虫草素合成的潜力。


研究内容


本文研究了在液态深层发酵过程中通过添加不同剂量的鱼藤酮,对蛹虫草CM001虫草素产量、菌丝生长及菌丝形态的影响。研究结果表明添加5 mg/L鱼藤酮可显著提高蛹虫草虫草素产量。转录组分析代谢组分析表明,鱼藤酮通过调控能量代谢和氨基酸代谢促进了虫草素在蛹虫草细胞中的合成。双组学联合分析表明,鱼藤酮使核苷酸的代谢途径向腺苷合成方向倾斜,同时上调虫草素合成基因(cns1-2)使腺苷转化为虫草素。


研究结果


Result1 鱼藤酮对菌丝生长及虫草素产量的影响

研究团队首先向液体培养基中分别添加1 mg/L的鱼藤酮和甲基紫精,以考察它们对虫草素产量的影响。结果表明,添加鱼藤酮可显著提高虫草素产量,而甲基紫精处理对虫草素的产生没有显著影响。为了证实鱼藤酮对虫草素合成的促进作用并获得最佳发酵条件,研究团队将不同浓度的鱼藤酮分别添加到液体培养基中,发现当添加浓度为5 mg/L时,虫草素产量较高且菌丝体生长抑制较低,因此5 mg/L被认为是最佳添加水平。


图1 |  不同类型/浓度外源辅因子对蛹虫草发酵菌丝生物量/虫草素产量的影响


Result2 鱼藤酮处理下发酵特性的评估

为进一步研究鱼藤酮对蛹虫草发酵的影响,研究团队在最佳鱼藤酮添加水平下对蛹虫草的发酵特性进行了评价。相较于对照组,鱼藤酮组菌丝生长期有1-2天的滞后,证明鱼藤酮的毒性抑制了菌丝体的生长。在对数生长期,鱼藤酮组虫草素产量显著增加。此外,还采用了Western blot法检测虫草素合成蛋白cns1和cns2的表达,结果表明鱼藤酮处理上调了cns1和cns2蛋白丰度。后续qRT-PCR验证也表明鱼藤酮处理上调了cns1和cns2基因的mRNA水平。


图2 | 鱼藤酮处理蛹虫草的发酵特性


Result3鱼藤酮处理下菌丝体形态的评价

通过对蛹虫草发酵过程中菌丝形态的观察,探讨鱼藤酮处理对蛹虫草菌丝形态的影响以及菌丝形态变化与虫草素产量的关系。结果显示,鱼藤酮处理组菌丝体在视觉上对照组更细且呈簇状,这与生长曲线的变化一致。通过观察鱼藤酮处理组和对照组的菌丝显微结构和超微结构形态发现鱼藤酮对菌丝细胞壁的破坏虽然不利于菌丝生长,但在发酵过程中可能促进了虫草素的胞外转移和转运。


图3 | 鱼藤酮处理前后菌丝形态变化


Result4 鱼藤酮对基因表达谱的影响

为了比较鱼藤酮处理引起的mRNA水平差异,研究团队进行了蛹虫草的转录组测序(RNA-seq)和生物信息学分析。分析结果表明鱼藤酮处理改变了发酵下蛹虫草的基因表达丰度,共鉴定出979个基因为差异表达基因(DEGs),其中455个显著上调,484个显著下调。通过GO富集分析进一步评价鱼藤酮处理后DEGs的生物学功能,结果表明,在生物学过程层面,更多上调的DEGs富集在各种氨基酸的生物合成和分解代谢中,大部分下调的DEGs富集在rRNA加工和药物、离子和己糖的转运过程中。在细胞组分层面,更多上调的DEGs富集在线粒体(尤其是线粒体基质)和细胞壁,大部分下调的DEGs富集在核仁和质膜中。在分子功能层面,更多上调的DEGs富集在氧化还原酶活性、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合和磷酸泛硫乙胺结合方面,大部分下调的DEGs富集在氨基酸或药物的跨膜转运蛋白活性上。鱼藤酮抑制ETC复合体功能导致线粒体功能障碍,因此分子功能水平富集的上调的DEGs作为负反馈维持氧化还原平衡和能量代谢,这也是细胞组分水平上调的DEGs在线粒体中更富集的原因。进一步结合qRT-PCR验证表明,在鱼藤酮处理下为虫草素合成提供的还原当量(NAD(P)H)很可能来自磷酸戊糖或糖酵解途径而非三羧酸循环。


图4 | 鱼藤酮处理下蛹虫草的转录谱分析


Result5 鱼藤酮对代谢物谱的影响

为了比较鱼藤酮处理引起的代谢水平差异,研究团队基于非靶向LC-MS的代谢组学分析了蛹虫草的代谢产物谱。鱼藤酮处理组和对照组之间的代谢物存在显著差异。共有1314种代谢产物被鉴定为差异代谢产物(DAMs),其中846个显著上调,468个显著下调。值得注意的是,由鱼藤酮处理引起的上调 DAMs远高于下调 DAMs,并且这些差异在前50个显著DAMs中也很明显。相应的,在转录组分析中,鱼藤酮处理引起的下调DEGs略高于上调的DEGs。这一证据表明,鱼藤酮通过抑制一些代谢途径导致相关代谢产物的积累,从而增加虫草素产量。通过KEGG富集分析来进一步探索各DAMs之间的代谢通路关系,发现与DEGs的GO富集分析结果一致,大多数DAMs富集在氨基酸代谢途径,其他DAMs富集在能量代谢和核苷酸代谢。已有研究表明,增加氨基酸总量可以促进虫草素的积累。鱼藤酮处理后大部分氨基酸的丰度上调,这为虫草素的合成提供了充足的氨基酸基础。


图5 | 鱼藤酮处理下蛹虫草的代谢谱分析


Result6 转录组-代谢组数据联合分析

研究团队发现DEGs和DAMs之间存在显著相关性,特别是前100位的DEGs和DAMs。通过进一步结合转录组代谢组数据集,确定了与代谢相关的KEGG Level 2共同差异通路,结果表明鱼藤酮诱导虫草素生物合成的增加可能涉及一个或多个初级代谢。值得注意的是,腺苷是虫草素的前体,主要来源于核苷酸代谢中的嘌呤代谢。且相关性分析显示,DEGs和DAMs在核苷酸代谢中也存在显著相关性。为进一步了解核苷酸代谢在鱼藤酮处理促进虫草素积累中的作用,研究团队基于KEGG通路数据库和已报道的虫草素代谢通路,筛选出部分相关基因和代谢产物。


结果显示,最初与IMP合成途径相关的基因和代谢产物大多上调,而与UMP合成途径相关的基因和代谢产物大多下调,这表明鱼藤酮处理导致更多PRPP和L-谷氨酰胺流向嘌呤代谢。然后,鸟苷合成途径相关基因大幅下调,这说明鱼藤酮处理会导致更多的IMP流向腺苷。然而,随着cns1-3的显著上调,3''-AMP和腺苷在虫草素合成过程中被大量消耗。因此,尽管有更多的PRPP和L-谷氨酰胺流向腺苷,但腺苷没有明显上调。此外,由cns3的HisG结构域所催化的喷司他丁也显著上调,这进一步导致腺苷的减少。综上所述,一方面,鱼藤酮处理改变了核苷酸代谢向腺苷的流动;另一方面,因鱼藤酮处理而上调的虫草素合成基因可以有效地将腺苷转化为虫草素。


图6 | 鱼藤酮处理下蛹虫草转录组和代谢组的综合分析


研究结论


本研究首次为虫草素的高效生产提供了在蛹虫草发酵中添加鱼藤酮的策略。能量代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢和虫草素合成路径的变化是鱼藤酮促进虫草素合成的主要原因。这项工作中的策略为解析虫草素合成机制提供了新的思路和见解,并展示了鱼藤酮在提高虫草素产量方面的巨大潜力。未来该研究团队拟利用遗传和分子生物学方法来进一步阐明鱼藤酮诱导虫草素合成的详细机制。

注:本研究相关专利《一种提高虫草素产量的蛹虫草液体发酵方法》(专利号:CN202210588715.8;申请公布号:CN115044636A)已在中国知网、万方数据库等平台公开。


You-Chu Ma, Ping Huang, Xiao-Ling Wang, Gao-Qiang Liu. Multi-omics analysis unravels positive effect of rotenone on the cordycepin biosynthesis in submerged fermentation of Cordyceps militaris. Bioresource Technology. 2023;373:128705. doi:10.1016/j.biortech.2023.128705.


作者介绍


马酉初,本文第一作者,中南林业科技大学生命科学与技术学院2018级博士生,主要研究方向为食药用菌生理代谢调控与发酵应用。近年来主持或参与湖南省研究生科研创新项目(重点立项)2项,参与申请国家发明专利5项,在Science Advance、Bioresource Technology、Science China Life Sciences、 Food & Function等期刊上以第一作者身份或参与发表论文6篇。


刘高强教授,本文通讯作者,中南林业科技大学生物学一级学科博士点负责人、湖南省科技创新团队负责人。主要从事森林生物学、林业生物技术领域的教学和科研工作。主持十三五国家重点研发计划“政府间国际科技合作”重点专项项目,国家自然科学基金面上项目、青年项目,全国“林草科技创新领军人才”项目,教育部“新世纪优秀人才支持计划”项目,湖南省自科(杰出青年)基金项目,十二五国家科技支撑计划任务等科研项目。近年来,以第一作者/通讯作者在Biotechnology Advances、Communications Biology、Biosensors and Bioelectronics、Bioresource Technology等国际重要期刊上发表论文30余篇(其中IF>10的论文5篇),获湖南省自然科学奖一等奖(第一完成人)。


详细介绍见:

https://sky.csuft.edu.cn/szdw/sbsrc/jybrc/201812/t20181223_83357.html


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END

排版人:小久


原创声明:本文由欧易生物(OEBIOTECH)学术团队报道,本文著作权归文章作者所有。欢迎个人转发及分享,未经作者的允许禁止转载。

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