项目文章丨IF=17！肠道菌群及代谢与血管功能再添力证

肠道菌群失调在血管功能障碍中起关键作用，据报道微生物多样性与动脉僵硬度呈负相关。然而，肠道微生物群在动脉僵硬度进展中的因果作用以及这种变化背后的特定物种和分子机制在很大程度上仍然未知。针对此问题，中山大学夏敏教授课题组在临床和动物模型上开展相关组学及验证研究，相关成果《Flavonifractor plautii Protects Against Elevated Arterial Stiffness》发表在Circulation Research（IF=17）期刊上。迈维代谢为本研究提供广泛靶向代谢组检测分析服务。

总计44名动脉僵硬度升高的受试者和45名年龄和性别匹配的正常对照者(不使用药物)、已确定的心血管疾病、肥胖、糖尿病和高血压(之前报告与肠道微生物群扰动相关)， 进行了分析。除动脉僵硬度增加的受试者的血压水平和长期心血管风险显著升高外，两组之间没有明显差异(表)。

然后，使用宏基因组分析粪便样本中的肠道微生物概况。在群落水平上，α多样性没有显著差异，β多样性有显著差异。此外，整合微生物物种的随机森林算法能够将动脉僵硬度升高的受试者与正常对照者区分开来，对分类有贡献的主要特征包括:类黄酮降解细菌F. plautii、Collinsella aerofaciens和Bacteroides ovatus(图1A)。

为了进一步排除生活方式对微生物种类和动脉僵硬度之间关联的潜在混杂效应，接下来进行了详细的成分分析，对年龄、性别、身体质量指数、吸烟、饮酒、体力活动、饮食多样性和肠道微生物群的α多样性进行了调整。完全调整后，共有13种与臂踝脉搏波传导速度(baPWV)显著相关。

其中，F. plautii和几个属于Lachnospiraceae科的物种(它们是众所周知的短链脂肪酸生产者)与动脉僵硬度升高呈负相关；鉴于，先前报告与炎症相关的菌种，如Ruminococcuscallidus和Eubacterium rectale以及属于Clostridium和Citrobacte的几种致病菌种与动脉僵硬度增加呈正相关(图1B)。

考虑到二元数据可能会限制对真实关联模式的理解，进一步研究了连续baPWV中微生物物种的相关性。Citrobacter freundii,Eubacterium rectate和Clostridium perfringens位列与连续baPWV呈强正相关的前3名，而F. plautii与连续baPWV呈最强负相关(图1C)。此外，发现F. plautii与血压呈负相关，血压是动脉僵硬度增加的主要危险因素(图1D)。

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图1 动脉僵硬度升高或不升高受试者的微生物改变

考虑到肠道复杂的微生物生态系统受到不同微生物群落中个体分类群的不均匀影响，且个体群落成员的生态作用对人类健康至关重要，因此进一步进行了共现分析，以探究介导动脉僵硬度的潜在最主要物种。值得注意的是，对照受试者网络的复杂性要高得多，其特征是物种间存在多重正相关(图2A)。基于高中介中心性和度中心性(探索每个生态系统内的关键物种的两个尺度)，F. plautii被确定为正常对照中最突出和最有影响的分类群，而动脉僵硬受试者的微生物网络中不存在。

此外，在校正主要混杂因素后，F. plautii和血压对动脉僵硬度存在双向中介效应(图2B和2C)。值得注意的是，收缩压(SBP)和舒张压仅解释了F. plautii对baPWV的部分总体影响(图2B和2C)，表明除了血压降低之外，还有其他未知机制介导F. plautii对下动脉僵硬度的保护作用。

更重要的是，尽管年龄较小且血压和血脂水平较低的代谢特征较好，但在一个独立的验证队列中，动脉僵硬度升高的受试者中也发现F. plautii显著更低。此外，在对微生物群的人口统计学、生活方式和α多样性进行调整后，F. plautii和baPWV之间的负相关性仍然显著。上述发现表明，F. plautii可能是维持血管健康的驱动物种。

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图2 在动脉僵硬度正常的受试者中，F. plautii是很重要的物种

为了进一步了解肠道微生物群的变化如何调节宿主代谢并促进动脉僵硬度的进展，在MetaCyc数据库中注释了微生物基因。尽管α多样性无明显差异，但在动脉僵硬度受试者和正常对照者之间发现了微生物功能的明显分离。经过调整后，发现共有41条途径(涵盖复杂的多糖代谢、氨基酸和脂肪酸生物合成)与连续baPWV显著相关(图3A和3B)。

值得注意的是，在动脉僵硬度升高的受试者的微生物群中，发现与短链脂肪酸密切相关的途径(如糖酵解、L-鼠李糖降解和同型乳酸发酵)下调，并且与已确定的心血管疾病风险因素(如肥胖和SBP病)呈负相关。根据天冬氨酸的抗高血压作用以及天冬酰胺与发生心血管疾病风险之间的反比关系，发现L-天冬氨酸和L-天冬酰胺生物合成与baPWV和脂质谱呈负相关(图3A至3C)。

相反，Clostridium和Citrobacter的致病物种与baPWV之间的正相关一致(图1A和1B)，发现提供致病微生物必需的磷酸甲基赤藓糖醇的代谢与baPWV和SBP呈正相关(图3A-C)。同样，与之前赖氨酸与代谢综合症严重程度密切相关的报告一致，即赖氨酸是导致动脉僵硬度恶化的既定因素，赖氨酸生物合成的微生物能力与连续baPWV均呈正相关(图3A和3B)。此外，发现参与L-精氨酸生物合成的几种途径(据报告其水平升高与梗死后死亡率风险增加相关)以及芳香族氨基酸及其前体(一类与心脏代谢风险因素密切相关的氨基酸)的生物合成能力与动脉僵硬度增强呈正相关。此外，脂肪酸生物合成，特别是硬脂酸盐生物合成，是一种能够诱导心脏细胞凋亡的饱和脂肪酸，经过调整后发现与baPWV升高呈正相关(图3A-3C)。值得注意的是，几乎所有与baPWV相关的途径也与F. plautii显著相关(图3C)。总之，这些数据表明，微生物代谢的不同能力与动脉僵硬度增加的进展密切相关。

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图3 动脉僵硬度升高或未升高受试者的肠道微生物功能变化

为了揭示可能与肠道微生物群相关的动脉僵硬度有关的代谢表型，在血浆中进行了代谢分析。共有54种代谢产物与连续baPWV显著相关(图4A和4B)，其趋势与动脉僵硬度升高或不升高的受试者的微生物群中代谢功能的改变模式基本一致。具体而言，麦芽糖的丰度(图4A，淀粉消化产生的主要产物)与动脉僵硬度增加呈正相关，这与baPWV与淀粉降解能力之间的正相关一致(图3B)。

此外，与baPWV升高受试者中增加的芳香族氨基酸生物合成的功能一致，发现芳香族氨基酸生物合成产生的2种副产物，1-乙酰吲哚和L-色氨酸胺的丰度与动脉僵硬度恶化呈正相关(图3B和4A)。另一方面，与baPWV升高受试者的L-天冬氨酸和L-天冬酰胺生物合成、糖酵解和随后的同型乳酸发酵、5 ''-磷酸吡哆醛生物合成和己糖醇降解能力受限一致(图3A和3B)，发现这些途径中涉及的主要前体或副产物L-半胱氨酸、2-脱氧核糖1-磷酸、O-磷酸-L-丝氨酸和L-丝氨酸的丰度与动脉僵硬度升高呈负相关(图4A和4B)。

此外，还发现参与糖酵解的主要中间代谢产物顺乌头酸(CAA)的丰度与连续baPWV均呈负相关(图4A和4B)。此外，尽管这些代谢产物中的大多数与动脉功能受损的既定因素(如血压、血清胆固醇和葡萄糖代谢)显著相关，但只有CAA和2，5-呋喃二甲酸与F. plautii呈显著相关(图4C)。此外，发现CAA与硬脂酸盐生物合成呈负相关，而2，5-呋喃二甲酸与SBP病和心血管疾病风险均呈负相关(图4C和4D)。总之，上述发现表明，CAA和2，5-呋喃二甲酸的增加可能是介导F. plautii对血管健康保护作用的主要信号转导因子。

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图4 动脉僵硬度升高或不升高的受试者之间不同的微生物群相关代谢产物

为了进一步探究微生物群改变与动脉僵硬度之间的因果关系，对接受常规抗生素处理的小鼠移植了来自4名baPWV升高的供体和4名匹配的对照受试者的微生物群(图5A)。总体上，受体小鼠复制了来自人类供体的大多数微生物群特征，包括F. plautii在内的许多微生物物种和代谢能力在受体小鼠和人类供体之间表现出相似的变化趋势。与移植对照组粪便的小鼠相比，移植患者粪便的小鼠在体重和身体组成方面没有表现出显著差异(图5B至5D)。

另一方面，移植正常对照组粪便的小鼠中，观察到SBP和舒张压显著降低(图5E)。一致地，对动脉运动(M)-模式的监测表明，移植患者的粪便导致颈动脉和腹主动脉中PWV显著降低但周向环应变升高(图5F和5G)，表明动脉僵硬度升高可通过FMT传播，且这种效应与肥胖无关。考虑到细胞外基质重塑(包括诱导异常胶原蛋白和减少弹性蛋白)是导致动脉僵硬度发展的主要病理因素，进一步进行了主动脉显微镜检查。尽管接受患者粪便移植的小鼠与接受正常对照组粪便移植的小鼠相比，在介质厚度(图5H)或胶原积聚(图5I)方面均无明显差异，但它们的弹性纤维断裂数量显著增加(图5J)。协同形态学改变，MMP-2(图5K和5L)，一种负责弹性纤维破坏的基质金属蛋白酶家族成员，在移植患者粪便的小鼠中显著增强，伴有MCP-1(图5M)，其激活吸引其他炎性细胞的表达。在接受来自baPWV升高受试者的FMT的小鼠中，NF-κB显著高于移植正常对照组的粪便的小鼠(图5N)。总之，这些发现进一步支持了肠道微生物群在动脉功能调节中的作用。

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图5 粪便微生物移植将主动脉表型转移给小鼠

为了突出新型微生物物种直接影响动脉僵硬度的潜力，进一步探究F. plautii在2种不同的动脉僵硬度模型中的保护作用，因为观察到(1)它在正常对照组中过度表达,( 2)在正常动脉僵硬度受试者的微生物网络中作为关键物种发挥作用。在动脉僵硬的人源化模型中，每天补充F. plautii 4周，导致粪便样本中F. plautii的丰度显著增加(图6A和6B)。

值得注意的是，虽然没有发现对体重和身体组成的明显影响(图6C至6E)，但补充F. plautii导致血压显著降低(图6F)，并且颈动脉和腹部动脉的PWV和周向循环应变显著改善(图6G和6H)。为了进一步证实F. plautii对动脉功能的保护作用，进行了Ang ii(血管紧张素II)诱导的动脉僵硬的经典模型。与人源化模型中的观察结果相似，与F. plautii的定居增加一致，用F. plautii治疗2周成功地挽救了由Ang II诱导的血压升高和血管僵硬度恶化。

此外，尽管在补充F. plautii后没有发现介质厚度和胶原积聚的明显差异(图6I和6J)，在人源化和AngII诱导的动脉僵硬模型中，用F. plautii治疗足以逆转弹性纤维断裂的增加(图6K)。此外，补充F. plautii能够抑制MMP2的激活(图6L和6M ),并在两种模型中将其伴随的血管炎症逆转至与正常对照相当的水平(图6N和6O)。总之，上述发现表明，F. plautii具有成为预防动脉僵硬的新型益生菌的潜力。

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图6 补充Flavonifractor plautii可减轻动脉僵硬度

为了突出新型微生物化合物直接影响动脉僵硬度的潜力，进一步确定F.plautii相关代谢物在动脉僵硬度的人源化模型中的作用。首次采用靶向代谢组学来验证和探究用F.plautii灌胃的小鼠中CAA和2，5-呋喃二甲酸的定量水平，F.plautii的2种潜在效应物来自人类宏基因组学和代谢组学分析的整合(图1至4)。在F.plautii干预后，在人源化和AngII诱导的动脉僵硬模型中，血清CAA达到对照的2倍；然而，在2，5-呋喃二甲酸中没有观察到明显的差异,表明CAA可能是赋予F.plautii保护作用的关键分子。

在动脉僵硬的人源化模型中用CAA治疗4周后(图7A)，尽管与赋形剂对照相比没有观察到身体组成的差异(图7B至7D)，但在用CAA灌胃的小鼠中发现血压显著降低，颈动脉和腹部动脉中的PWV和周向循环应变显著改善(图7E至7G)。与F. plautii干预中发现的保护作用相似，补充CAA对中膜厚度和胶原沉积没有明显的影响，但对弹性蛋白断裂有显著的保护作用(图7H至7J)。用CAA治疗的小鼠主动脉中MMP2表达的减少(图7K和7L)和炎症活化(图7M和7N)进一步支持了弹性纤维网络的这种改善。综上所述，本研究结果表明CAA是F. plautii维持血管弹性网络的主要效应因子。

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图7 CCA抑制动脉僵硬小鼠的MMP2活化并减轻弹性蛋白断裂

本研究揭示了肠道菌群失调与动脉僵硬度之间的因果联系。动脉僵硬度升高的部分原因是肠道中F. plautii减少，导致MMP2活化增强，进而加重血管弹性断裂。从临床角度看，这些发现提出了靶向肠道微生物群个体物种以管理动脉僵硬度的可能性。

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