澄清过滤新方式，让你不再“恐高”

高细胞密度收获的趋势和挑战

在抗体工艺中，澄清作为承接上游，开启下游纯化的工艺单元，起到去除杂质和减轻下游层析纯化负担的作用。近年来，细胞株的开发、良好的培养基设计以及培养方式令上游抗体表达量逐渐提高，可达到10g/L。而高滴度表达往往伴随着高细胞密度，可达20x10^6 cell/ml，甚至更高。这类收获液含有更多固含物（细胞碎片和胶体）和可溶性工艺相关杂质（宿主DNA和蛋白质），给常规的澄清技术带来挑战：

使用碟式离心机+常规的深层过滤：

对高密度细胞收获液离心，需要更频繁地进行沉降卸料和更大的离心加速度，生成较大的离心颗粒，这有可能会导致收率下降。离心后的浊度依然比较高，后续的深层过滤可能会出现过早堵塞的风险。

使用常规的深层过滤器作2级过滤：

常规深层过滤器的过滤空间设计有限，不足以容纳高密度收获液中显著增多的杂质，容易出现过滤器载量低的情况，需要更多的过滤器面积和系统夹具，对成本控制、有限的厂房空间和生产操作来说，都是挑战。

絮凝如何解决问题

为了克服这类工艺挑战，近年来各种收获液预处理方法开始受到关注，包括加入硅藻土粉末或者絮凝剂。硅藻土粉末作为助滤剂，在膜表面形成渗透性滤饼避免堵塞从而提高载量，但往往添加量较大，且需要添加粉末和混匀等多步操作。而絮凝则是一种操作更方便且有效的方式。当分子间范德华力大于静电排斥时，发生絮凝反应，能使体系中分散的小颗粒聚集，形成尺寸较大的颗粒。阳离子聚合物是常见的絮凝剂，并且广泛应用于水处理工艺。近十年，越来越多研究关注其在生物制药的应用。

pDADMAC阳离子聚合物是一种能够应用于高细胞密度收获的絮凝剂，通过电荷作用，pDADMAC能有效絮凝收获液中的带负电杂质，包括细胞碎片、HCP、DNA等，形成大的颗粒。使用方法非常简单，只需要把一定量的絮凝剂加入生物反应器，等待约30分钟，即可完成絮凝。

使用模式蛋白收获液做对照试验，对收获液作不同处理：未作预处理（pH 7）；酸处理（pH 4.8）；加入pDADMAC絮凝（0.0375% w/v）。结果显示，2组经过预处理后的料液，其粒径分布右移，整体颗粒尺寸变大，pDADMAC实验组的尺寸变化更加显著，絮凝效果最佳。

与絮凝搭配使用的过滤技术

经过絮凝后，分散的小颗粒聚集成大颗粒，更容易被过滤去除。但是如果使用常规的深层过滤器处理絮凝后的料液，会出现载量较低的结果，因为传统深层过滤器的孔径设计不适用于大粒径分布的料液。为此，默克优化了现有过滤膜结构，推出了和絮凝剂搭配使用的Clarisolve®系列深层过滤器，具备多层密度梯度的过滤结构和超大容污空间，有效处理絮凝后料液。考虑到收获液的细胞密度、活率等有差异，使用絮凝剂可能会得出不同的粒径分布，Clarisolve®系列深层过滤膜设计了3种介质，满足大部分絮凝料液的过滤需求。

使用模式蛋白进行实验对比，收获液细胞密度为17.8*106 cells/ml，表达滴度为1.2-1.3g/L，细胞活率为56%，含有较多细胞碎片和可溶性杂质。分别使用2种方式处理收获液：1）直接使用常规两级深层过滤D0HC+X0HC；2）使用pDADMAC絮凝剂后，使用Clarisolve®系列膜包进行深层过滤。

实验结果显示，使用絮凝剂搭配Clarisolve®系列膜包的实验组有更高的初级澄清载量，是未经过预处理的2级深层过滤实验组的2-3倍。并且具有更好的DNA去除效果和相当的HCP去除效果。

放大到2000L规模，按照上述载量结果和30%的安全系数，计算得出所需膜面积。常规的深层过滤总共需要26m2的深层过滤器，而絮凝剂处理后的料液只需要7m2的Clarisolve®深层过滤器，减少73%的过滤器面积。Clarisolve®深层过滤器的结构专为絮凝后料液处理设计，能有效过滤颗粒分布和尺寸较大的料液，显著减少过滤器的用量，一步深层过滤即可轻松处理完料液。

絮凝剂pDADMAC去除和检测

pDADMAC作为外源添加物，需要被去除，并且残留水平达到可接受的水平，以确保药物安全。毒理学研究表示，1ppm浓度下的pDADMAC未观察到细胞毒性和急性神经毒性，也未发现刺激性 (皮内注射）或溶血效应。1ppm可以被用作目标pDADMAC残留水平。

抗体后续的纯化工艺都能起到去除絮凝剂的作用，层析会清除大部分的絮凝剂。我们对不同步骤后pDADMAC残留水平进行检测，初始浓度选自pDADMAC常规使用的浓度范围。结果显示，在阴阳离子层析步骤后，pDADMAC残留水平已经减少至1ppm以下。

检测pDADMAC残留可以使用2种方法：使用HPLC，用一个标准的RP-18柱作对照，通过蒸发光散射检测器 (ELSD) 和质谱仪 (MS) 检测 pDADMAC 的残留水平。文末链接的应用指南含具体实例。也可以使用表面等离子共振（SPR）对絮凝剂的残留水平进行过程中监控。

BioReliance® 验证服务: pDADMAC残留定量检测

我们提供pDADMAC残留量检测的服务，对收获后、澄清后、层析前后等不同的工艺节点的料液进行样品检测，出具详尽的报告，出具的报告包括所提交样品的描述、聚合物残留物的定量和色谱图叠加(包括标准品）。最终报告以PDF电子文件格式出具，该格式的文件可以直接提交给监管部门进行审批。

总结

上游技术的迅速发展使得细胞培养收获液的密度日益提高，为传统的澄清技术带来挑战。pDADMAC絮凝剂能够有效降低料液的粒径分布，搭配Clarisolve®系列深层过滤膜，能够改善过滤效果，提高载量。无需离心，无需大面积的过滤器，仅需小剂量的絮凝剂和更少的过滤器，助您轻松应对高细胞密度料液澄清。

pDADMAC絮凝剂搭配Clarisolve®过滤器应用指南

参考资料：

Sladjana Tomic et al., Complete clarification solution for processing high density cell culture harvests. Separation and Purification Technology 141 (2015) 269-275

Fischer D, Li Y, Ahlemeyer B, Krieglstein J, Kissel T. 2003. In vitro cytotoxicity testing of polycations: Influence of polymer structure on cell viability and hemolysis. Biomaterials 24(7):1121–113

pDADMAC flocculant reagent for use with Clarisolve® depth filters App Note

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