干货：每剂量病毒颗粒的估算（下） ——Safety Margin的估算

2023-02-13 10:25:27, Fei Gao Merck工艺解决方案

前言

2021年1月，国家药典委员会和食品药品国际交流中心出版《治疗用生物制品病毒风险控制要点》。

结合在病毒安全控制中的服务经验，默克工艺解决方案陆续分享了几篇对《要点》的解读。上一篇我们讨论了“起始病毒颗粒数的定量”，本篇继续讨论“5.3.5每剂量病毒颗粒的估算”。

当拿到了UPB的病毒颗粒TEM计数，拿到了病毒清除挑战实验的Final Report，如何估算出药物终产品DP的Safety Margin？本篇将讨论一下在安全评估过程中的数据的获得与计算。

图1. 病毒清除的关键纯化步骤

“病毒灭活/去除工艺的建立与”是一项严谨的工作，需要定量化的标准，来评价工艺的清除能力。但过于死板的标准或许不利于医药技术的革新，各国的法规都不会给出“一刀切”标准。

《药典2020版》提出了全面的要求，但并没有规定清除能力需要的log数。WH0 04版指导原则与CDE 05 版《一般原则》都提出“≥4 logs为有效步骤”；ICH Q5A 和《要点》都给出了针对内源病毒清除能力计算的“示例”，方便业内参照进行评估。

ICH Q5A Appendix 5示例中，生物制品的病毒数为：<10^-6 particle/dose。《要点》5.3.5示例中，生物制品的病毒数为：<10^-7.55 particle/dose。并不是最新版《要点》提出了更高的要求，ICH示例中“低于百万剂量分之一”，一直是业内普遍认可的 “金标准”。当然话说回来，法规的要求是Minimal的底线，药物终产品DP的Safety Margin肯定是需要高于Minimal的底线的。

一

单步清除效率的定量

在病毒挑战实验中，单步的清除效率的定量方法，通常会选择基于指示细胞培养的TICD50(半数组织培养感染剂量)法和qPCR的方法。TCID50并不能精确定样本中挑战病毒的颗粒数，而是测量致使50%细胞感染时的样本的稀释倍数（图2所示）。

在病毒挑战实验中，在纯化单元（Unit Operation）起始料液中加入模型病毒，采用TCID50的方法比较起始料液与纯化收集料液中病毒量的相对变化，来定量该纯化单元对模型病毒的清除能力。

qPCR的方法，可以根据事先标定的标准曲线（图3所示），精确定量起始料液和收集液中模型病毒基因的copy number，来计算纯化单元对模型病毒的清除能力。定量计算方法的推导可以参考上一篇《要点解读》。

TCID50终点计算方法，参考Spearman Kärber 公式，该计算方法发表在Federal Gazette No.84，May，1994；与Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infection, 6th Edition，1998。

在使用TCID50定量过程中，还经常会遇到待检测料液会对指示细胞产生毒性，影响定量结果。因此在病毒挑战验证前，需要通过预实验（Pre-study）来摸索待检测料液的稀释比例，通过稀释来消除对指示细胞的毒性。稀释会影响TCID50的检测下限，如样本稀释5倍，检测下限的log值提高0.7（log5≈0.7），样本稀释10倍，检测下限log值将提高1.0（log10=1）。

通过增加TCID50的检测平板数，即采用更多平板进行大体积检测（Large volume plating），可以有效降低检测下限。如将检测体积提高1倍，检测下限log值将降低0.3；将检测体积提高到5倍，检测下限log值将降低0.69。为了满足大体积检测的需要，需要各个检测组分有足够的收集体积，这也就是对小模型（Scale-down model）的缩小比例提出了要求。根据BioReliance®的经验，在不需要稀释和Backup的情况下，收集液有30 ml，甚至到60 ml，是有利于开展TCID50大体积检测的。

图2. 检测“致使50%细胞感染”的稀释倍数

图3. 采用qPCR的方法进行病毒颗粒定量

当单一纯化单元存在两种以上病毒清除机理时，譬如使用酸性洗脱液的亲和层析，既包含层析的去除机理，又包含了低pH的灭活机理。根据ICH Q5A的要求，需要分别阐明病毒去除机理，不能混为一谈。“whether it is due to inactivation or removal.（ICH Q5A）”在亲和层析的洗脱液中，包膜病毒（如MuLV）会进一步被低pH溶液环境灭活，用TICD50的方法不能区分清除与灭活两种机理的贡献。但如果用qPCR的方法，检测得到的是病毒基因的数量，既能检测到完整病毒，也能检测到包膜被破坏的病毒基因。从而可以准确定量层析机理的清除能力，排除了低pH灭活机理的贡献。毕竟亲和收集液中被低pH灭活病毒尸骨尚存，病毒包膜被破坏了，但DNA还在。所以在亲和层析一步，往往用qPCR定量包膜病毒的清除，又可以用TICD50法定量非包膜病毒的清除。

根据qPCR的原理，该方法并不适用于病毒灭活步骤的定量，如低pH灭活与S/D灭活的病毒定量。由于qPCR的方法成本较高，所以在病毒挑战实验中，一般策略是以TICD50定量为主，qPCR定量为辅助。当然土豪除外。

单步的病毒清除能力（Viral Log Reduction Factors, LRF）可以按照以下公式计算。对同一样本多次TICD50策略，取平均值记为该样本的Virus Titre/ml。对计算结果取对数，获得单步清除的log值。

二

纯化工艺的总清除能力

累加各个纯化步骤的LRF，即获得验证工艺的LRFTotal，使用如下公式计算，最终结果也是以log值表达。对同一纯化步骤，如果进行多次验证，取最差的验证结果，即最小的LRF值。

LRF累加后，95%的置信区间半宽的计算参照以下公式。

举个栗子，如在BLA申报阶段，病毒清除验证考察了亲和层析（Affinity）、低pH灭活（Low pH）、阴离子层析（AEX）和除病毒过滤(VRF)，考察病毒为MuLV、PRV、Reo3和MMV，验证样品取自两批生产的中间品，RUN1和RUN2。病毒挑战实验的结果如表1所示例。

表1. 病毒挑战实验各批次LRF举例

AFFINITY

RUN1

RUN2

MuLV (qPCR)

2.66±0.31

2.88±0.35

PRV (qPCR)

2.33±0.13

2.22±0.09

Reo3

2.99±0.23

2.77±0.35

MMV

2.11±0.31

2.44±0.36

LOW PH

RUN1

RUN2

MuLV

4.55±0.35

4.66±0.23

PRV

≥4.88±0.34

≥4.77±0.35

AEX

RUN1

RUN2

MuLV

5.66±0.23

5.55±0.35

PRV

≥6.33±0.13

≥6.22±0.09

Reo3

8.11±0.23

7.77±0. 35

MMV

4.44±0.31

4.11±0.36

VRF

RUN1

RUN2

PRV

5.66±0.36

5.88±0.35

PRV

6.33±0.13

6.22±0.09

Reo3

5.99±0.23

5.77±0.35

MMV

4.11±0.31

4.44±0.36

针对每个步骤、每种病毒都开始平行的两次挑战实验，由于验证条件一致，LRF也会是相近的结果。如果平行实验的LRF差异在1个log以上，需要注意是否存在操作偏差。

比较平行实验的LRF值，取更低，用于累加LRFTotal的计算。在计算95%置信区间半宽ETotal时，也只需要考虑较低LRF的E值。当验证步骤的LRF≤1个Log时（注意包含等号），该步LRF将不计入LRFTotal。当样本中病毒Titre低于检测下限时，单步LRF值之前会出现“≥”号，需要带入累加公式计算。

基于这些原则，该工艺4个步骤对MuLV的总清除能力，和95%置信区间半宽，计算结果如下。其他3种模型病毒的清除能力，采用相同的计算方法。

对于多次平行挑战实验的LRF，通常采用最小值进行累加计算，算是一种Worst-case的思路。在比较LRF值时，并不需要考虑95%置信区间，并不需要减去95%置信区间半宽再进行比较。在评价是否≤1个log值，或≥4个log时，也不需要减去置信区间半宽。当然，置信区间半宽越窄，说明LRF的可信度越高。

三

Safety Margin的估算

如前文所述，各国法规都没有对病毒安全性的Safety Margin给出 “一刀切”硬性要求，ICH Q5示例中“低于百万剂量分之一”一直是业内普遍认可的对内源病毒控制的“金标准”。

前面转述了一遍LRFTotal的累积计算，这里再将ICH Q5A的公式转载一遍，与《要点》采用的计算公式是完全一致的。公式输出值为单位剂量的病毒颗粒数，计算公式的分母为前文所述的LRFTotal，分子为两项的乘积，前一项是UPB中类病毒颗粒的浓度，后一项为单一剂量药物对应的UPB体积。

按照“低于百万剂量分之一”的金标准，病毒清除验证的最终结论，需要达到Estimated Particles/dose < 10^-6 particle/dose。将《要点》183页的举例输入公式，该示例的Safety margin达到了10^-7.55，是超出“金标准”的。

在上一篇《要点解读》中，我们介绍了UPB中类病毒颗粒数的计量方法，包括传统的电子显微镜TEM计数法和qPCR的计量方法，介绍了对内源Type C颗粒的TEM与qPCR计量的成熟方法，还讨论了采用qPCR计量非内源病毒初始量的思路。上一篇《要点解读》刊出后，我们收到了很多业内同行的反馈，肯定了qPCR方法在病毒颗粒计数上的应用。

单一剂量DP对应的UPB体积，在ICH Q5和《要点》中，都给出了1000 ml/dose的示例。根据目前抗体发酵与纯化水平，以5 g/L的UPB初始Titre计算，参考50%的纯化收率，按照200 mg/dose的给药剂量，单一剂量DP对应的UPB只有80 ml。生产工艺的提高，也减轻了病毒风险控制的压力。

本篇解读，在《要点》示例的基础上，结合BioReliance®的工作经验，介绍了数据的获得与计算过程，希望对业内同行有帮助，我们也希望业内专家给我们反馈更多意见，督促我们不断进步。我们会总结大家的问题与建议，在后续的章节中继续讨论与病毒清除相关的关键工艺参数、最差工艺条件、缩小模型验证等问题。