【NIFDC文献系列赏析】——采用icIEF技术指纹识别新冠病毒三聚体RBD

19年末，新冠疫情席卷全球。面对突如其来的疾病，来自全世界的科学家着力研究疫苗和药物来应对疫情。研究发现病毒的刺突蛋白（Spike Protein）在较短时间内，其天然构象在宿主感染过程中扮演了免疫抗原的角色。

刺突蛋白是一种分子量为150kDa的跨膜糖蛋白，在病毒颗粒表面上形成了一个同源三聚体。其中远端S1亚基结构上分为4各不同的结构域：

N端结构域（NTD）

受体结构域（RBD）

C端结构域1(CTD1)和C端结构域2 (CTD2)

RBD结构域主要与宿主细胞表面的受体血管紧张素转换酶2（ACE2）结合，从而介导宿主细胞的病毒感染。

由于自然选择，病毒RBD区域的突变可能会增加病毒对ACE2受体的亲和力，减弱中和抗体作用，增强病毒毒力和传染性。这将加速病毒的逃逸，降低疫苗的保护作用。因此针对多种病毒流行株，刺突蛋白和RBD是广谱疫苗的靶向目标。（背景信息请参考新冠抗体开发专题）

图1

Delta和Omicron新冠变异株在RBD上的突变 （引用自文献）[1]

2022年12月，中国食品药品检定研究院（NIFDC）研究团队利用全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术（icIEF）表征了新冠病毒三聚体RBD的电荷异质性。在经优化的实验条件下，绘制了CHO细胞表达三聚体RBD天然构象的cIEF-WCID指纹图谱。该图谱可用于新冠病毒三聚体RBD的鉴定、批间一致性和稳定性研究，可作为疫苗生产过程中的质量控制策略一部分。相关研究结果发表在《Analytical Biochemistry》上。[2]

结果展示

1

新冠病毒三聚体RBD电荷变异体

研究人员使用生物信息学工具ProtParam，得到三聚体RBD的理论pI值为9.02。为了真实反映电荷的非均质性和与理论等电点的接近程度，研究人员采用范围较广的两性电解质(3-10)和范围较窄的两性电解质(8-10.5)以1:3的比例混合，确定了样本pI的区间范围在6.67 - 9.54之间(共20个峰) ，如图2所示。

图2

数字标记为1-20的峰为样本的电荷变异体

2

为了消除缓冲液干扰，

无需进行脱盐处理

研究人员还采用脱盐处理来提高峰间的分辨率，减少盐组分对检测结果的潜在干扰。经过处理，将原配方缓冲液替换为纯净水。结果表明，在脱盐处理前后，样本的峰型没有明显变化，说明缓冲液对三聚体RBD的指纹没有明显影响，如图3所示。

图3

蓝色脱盐处理前

绿色脱盐处理后

3

测定电荷变异体较多的蛋白时，

样本浓度应足够高

与其他单一pI值的重组蛋白样本相比(如单克隆抗体)，三聚体RBD的上样负载必须达到mg/ml的水平，才能获得分离良好和合适的样本噪声比(S/N)的电泳图。在本研究中，当浓度达到1 mg/ml时，S/N值更高，且峰形更明显(加载量达到20 μg/每次注射)如图4所示。

图4

绿色样本浓缩前

蓝色样本浓缩后

4

cIEF-WCID指纹图谱

可以反应批次间一致性

批次间一致性对于蛋白药物生产的质控是必不可少的。为了评估该方法的重现性和批次间一致性，对每批次三聚体RBD进行了三次试验。收集pI值和峰面积进行分析。每个试验共检测到20个峰，可分为3组，分别为<7.0(组1)、7.0-9.0(组2)和>9.0(组3)，如图5所示。

图5 

a: #1批次；b:  #2批次；

c: #3批次；d: #1批次, #2批次 & #3批次

5

三聚体RBD在37℃ 7d时稳定

为了探索在加速稳定性试验中，电荷异质性的变化，将缓冲液和三批次样本在37℃下孵育1d、3d和7d，以评估热稳定性。三聚体RBD的指纹图谱即使在37℃下孵育7d也没有明显变化，如图6所示。

图6

绿色37℃孵育1d

灰色37℃孵育3d

粉红色37℃孵育7d

6

氧化不影响三聚体RBD电荷异质性

H2O2作为氧化剂，被研究人员用于考察氧化对三聚体RBD电荷异质性的影响。将最终浓度为0.003%、0.009%和0.015%的H2O2用于过量氧化三聚体RBD。在即使添加0.015%的H2O2的条件下，样本的指纹图谱、pI值和峰面积保持不变，如图7所示。

图7

绿色使用0.003% H2O2处理

蓝色使用0.009% H2O2处理

灰色使用0.015% H2O2处理

7

pH值的影响

研究团队还以电荷变异体组成的变化为指标，探讨了pH值对三聚体RBD稳定性的影响。正如预期，即使在极酸性条件下(约3.5)，电荷变异体没有变化，但在碱性条件下(约10.0)，电荷变异体完全改变，如图8所示。

图8

绿色添加5M HCl

蓝色添加5M NaOH

灰色未添加

总结

①本文利用icIEF技术对新冠病毒三聚体天然构象RBD的电荷异质性进行了分析和评价。该方法在相关鉴定、生产批次间一致性评价、生产工艺一致性、稳定性研究等方面的适用性也得到了证实。

②同时作者指出，如果能利用icIEF-MS技术分析这些电荷变异体究竟是如何形成的，以及这些电荷变异体如何影响三聚体RBD疫苗的免疫原性，则更有利于开发针对多种新冠病毒变异株具有广谱活性的疫苗。

重磅新品敬请期待

Maurice全自动蛋白质表征系统引领了大分子蛋白药物分子量大小和电荷变异体的金标准，同时具备CE-SDS和icIEF两种检测模式，双模式皆符合2020版药典。

图5 Maurice特点

参考文献

[1] Wu L ,  Zhou L ,  Mo M , et al. SARS-CoV-2 Omicron RBD shows weaker binding affinity than the currently dominant Delta variant to human ACE2[J]. 信号转导与靶向治疗（英文）, 2022(002):007.

[2]Du J, Wu G, Chen Q, Yu C, Xu G, Liu A, Wang L. Fingerprinting trimeric SARS-CoV-2 RBD by capillary isoelectric focusing with whole-column imaging detection. Anal Biochem. 2022 Dec 28;663:115034. doi: 10.1016/j.ab.2022.115034. Epub ahead of print. PMID: 36586502; PMCID: PMC9794521.

-   新冠抗体开发专题   -

①中国队的声音丨加速新冠抗体药物的开发

②Maurice助力新冠抗体药物开发2

③icIEF技术助力新冠抗体药物开发

-   NIFDC文献专题   -

①【NIFDC经典文献系列赏析】融合蛋白电荷变异体表征先进技术

②【NIFDC文献系列赏析】自发荧光iCIEF表征rhEPO技术新进展

③【NIFDC文献系列赏析】CE-SDS表征mAbs联合验证

④【NIFDC文献系列赏析】自发荧光iCIEF指纹识别人诺如病毒样颗粒疫苗

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