应用指南丨使用Platinum II Taq热启动DNA聚合酶进行细菌DNA检测

Invitrogen™ Platinum™ II Taq热启动DNA聚合酶配备创新型Platinum™ II PCR缓冲液，可使用通用引物退火温度。这是因为反应缓冲液中的等稳定分子增强了退火过程中的引物-模板双链体的稳定性，进而在无需优化单个引物对的退火温度的情况下增强特异性。因此，来自简并引物群的不同引物变体将在同一PCR运行中以相似的效率与其特异性靶标结合。

此外，Platinum II Taq热启动DNA聚合酶是一种专为抑制剂耐受性而设计的酶，能够对纯度欠佳的样本进行成功的PCR扩增，从而解决从环境或临床研究样本中分离出的DNA样本的常见挑战。由于Platinum II Taq热启动DNA聚合酶可以检测低至几个拷贝的靶标，因此尽量减少残留细菌DNA（市售酶中很常见）就显得极为重要，因为需要通过减少该类残留来防止意外扩增不需要的序列。在制造Platinum II Taq聚合酶的过程中，采取了严格的控制措施，并确认每单位聚合酶中残留细菌基因组DNA的拷贝数不超过一个。

本指南将介绍Platinum II Taq热启动DNA聚合酶及其缓冲液的使用方法，以便使用靶向细菌16S rRNA基因的保守区的简并引物，快速便捷地在具有低含量细菌基因组DNA的样本中检测细菌DNA。

● Invitrogen™ Platinum™ II热启动PCR预混液（2X）（货号14000012）或Platinum II Taq热启动DNA聚合酶（货号14966001）

● Invitrogen™ dNTP混合物，每种10 mM（货号18427013；仅单酶需要）

● 正向和反向引物

● 25 mM MgCl2（可选）

● Invitrogen™ E-Gel™通用琼脂糖凝胶或等效产品

对于不同的PCR条件，建议根据下表1-3中的原则进行反应设置和热循环。Platinum II Taq聚合酶的使用可使反应设置更为灵活，而Platinum II热启动DNA预混液（2X）包含除引物和模板DNA之外的所有必要反应成分，可缩减设置时间和移液步骤，从而为研究人员提供更多便利。另外，还提供了有关反应优化的其他建议。

表1.使用预混液进行PCR的反应条件。

*使最终反应液中的MgCl₂浓度为1.5 mM。**建议用于GC含量>65%的靶标。

表2.使用单酶进行PCR的反应条件。

*使最终反应液中的MgCl₂浓度为1.5 mM。**建议用于GC含量>65%的靶标。

表3.循环方案。

*即使细菌基因组DNA的上样量较低，30次PCR循环也足以扩增靶标。**Platinum II PCR缓冲液具有独特成分，因此对于根据常规引物设计规则设计的大多数引物对，其退火温度均为60°C。当退火温度需进一步优化时，建议测试不同的退火温度或重新设计引物。

为使用E-Gel琼脂糖凝胶实现最佳分离，应将PCR样本稀释5-20倍。

为评价Platinum II Taq热启动DNA聚合酶检测低含量细菌DNA的灵敏度和效率，我们使用了靶向细菌16S rRNA基因保守区的简并PCR引物系统。所设计的引物（正向5′-ATT GAC GGG GRC CCG CAC和反向5′-CGA GCT GAC GAC ARC CAT GCA，其中R可以是A或G）高度覆盖几乎所有细菌门，因此，适用于检测广泛的微生物基因组DNA^[2]。为使用单酶进行PCR，将Platinum II Taq聚合酶与其缓冲液、dNTP、简并引物和0.01-1 ng来自各种细菌的纯化基因组DNA混合。循环方案如下：94°C下1个循环，持续2分钟；94°C下每次循环持续15秒、60°C下持续15秒、68°C下持续15秒，三个温度下共进行30次循环。为了进行分析，使用TAE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶通过电泳分离PCR产物。如图1所示，在低至0.01 ng的DNA起始量中，使用Platinum II Taq聚合酶可成功从每个受试菌种中扩增16S rRNA靶DNA，且特异性较高。同时，未添加DNA的反应液（无模板对照）未显示任何扩增，表明没有残留细菌DNA。

图1.使用靶向16S rRNA基因的引物检测细菌DNA。在30个PCR循环中，通过使用带有简并引物的Platinum II Taq热启动DNA聚合酶，从来自不同细菌的0.01-1 ng纯化基因组DNA中扩增16S rRNA基因片段（大肠杆菌中为153 bp）。使用Thermo Scientific™ ZipRuler™ Express DNA分子量标准品2作为尺寸标准品。NTC：无模板对照。

开发Platinum II Taq热启动DNA聚合酶的目的是增强对抑制剂的耐受水平，从而防止抑制剂对PCR反应的阻碍。我们进行了一项测试，用以检验当反应液中包含源自全血的抑制性物质时，扩增细菌DNA的效率是否会受到影响。为了进行这一实验，我们使用Platinum II Taq聚合酶和简并引物重新进行了PCR运行，反应液的制备过程为，将0.1 ng细菌基因组DNA掺入含有1%（v/v）全血的50 µL反应混合物中。根据全血PCR反应的建议，将反应液中的MgCl2浓度增加至4.5 mM。循环方法与前述方法相同。完成PCR后，在TAE缓冲液中的2%琼脂糖凝胶中分离产物。所有反应均显示出强大的扩增信号，表明已成功从所有受试细菌基因组DNA中检测到保守16S rRNA编码片段，这意味着Platinum II Taq聚合酶即使在纯度欠佳的样本中也能够利用简并引物进行有效的DNA检测（图2）。

图2.检测全血中的细菌DNA。使用Platinum II Taq热启动DNA聚合酶细菌，通过30个PCR循环对存在1%（v/v）人类血液的反应液中的细菌16S rRNA基因的保守区（大肠杆菌中为153 bp）进行扩增。加入MgCl2，直至反应液最终浓度达到4.5 mM。使用Thermo Scientific™ FastRuler™ Low Range DNA分子量标准品作为尺寸标准品。NTC：无模板对照。

Platinum II Taq热启动DNA聚合酶对抑制剂高度耐受，且与其搭配使用的独特Platinum II PCR缓冲液可使具有不同序列的引物均在60°C下有效退火，因此简化了PCR工作流程，可在环境或临床研究样本中完成灵敏且可靠的细菌DNA检测。

➣ 一款得心应手的Taq DNA聚合酶，应该是什么样子？

➣ Platinum II Taq热启动酶在高通量PCR中的应用