让细胞计数更稳：自动化成像如何提升准确性与精密度

血球计数板操作灵活，但也引入了较多人为差异：聚焦是否准确，光强是否合适、边界细胞是否纳入、碎片是否排除、活/死细胞如何判读，都会影响结果。不同操作者对同一样本的判断不一致，是手工计数差异的重要来源。

Countess 3 / Countess 3 FL 通过自动对焦、自动光照和定量图像分析，将原本依赖经验的步骤标准化，减少人为主观判断对结果的影响。

• 制备均一的单细胞悬液，上样前立即混匀。

• 需要染色时，固定染色比例、时间和操作方式；当使用台盼蓝染色时，通过离心或从试剂管顶部吸取的方式，来避免颗粒物的污染。

• 平稳加载计数 slide，避免气泡；上样后静置约20秒，使细胞沉降到统一焦平面。

• 选择或建立合适的 instrument protocol，优先使用自动对焦和自动光强。

• 检查细胞识别结果，并使用一致的 size、circularity、intensity 等 gating 条件。

• 需要高精密度时进行技术重复，并导出结果和图像，便于追溯。

同一 slide 在同一仪器上重复测量时，技术重复 CV 可低至约1-2%；独立取样产生的 biological replicate CV 约为11%。这说明样品处理、混匀和移液往往比仪器本身贡献更大的变异。

明场光照过强会降低细胞边界对比，光照不足则会提高背景并模糊目标；荧光计数中，激发强度需要在提高信噪比和避免图像过曝之间取得平衡。

如果需要比较不同样本间的荧光强度，建议使用 Countess 3 FL 的 FL lock 固定 LED 强度，避免自动光照导致不同样本的强度设置发生变化。

明场

荧光

Gating 用于排除碎片、非目标对象和异常形态细胞。常用参数包括 size、circularity 和 intensity。对于需要比较的样本，必须使用一致的 gating 策略，否则阈值变化本身就可能成为新的偏差来源。

建议将经过验证的 gating 条件保存为 protocol，在同一实验、同一项目或同一团队内复用，保证跨操作者和跨批次结果更可比。

同一仪器上的技术重复 CV 较低，独立取样产生的变异更高。

资料来源：Thermo Fisher Scientific 应用说明《Improving cell counting accuracy and precision with automated, image-based counting》，APN-14182675。

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