怎样轻松快速地完成分子克隆？一文读懂秒变高手（下）

2023-01-28 12:18:45, 赛默飞生命科学赛默飞世尔科技生命科学产品

上篇我们对经典分子克隆技术和无缝组装克隆技术进行了比较，经典分子克隆兜兜转转、如琢如磨，而无缝组装克隆技术却能做到操作简单和方便快捷。那它究竟是如何实现的呢？本期我们就来具体聊聊无缝克隆的四步致胜奇招。

基于同源序列的无缝组装克隆技术，关键是利用PCR引物，在目标片段两端引入与线性化载体两端同源的一段序列。基本策略是：

选定插入外源片段的位置，以此线性化载体

设计包含线性化载体两端序列和目标片段两端序列的引物，扩增目标片段

扩增片段与线性化载体、组装预混酶混合反应

转化感受态细胞

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Step 1

如果载体上正好有合适插入目标片段的酶切位点，酶切载体使之线性化。为了降低单酶切载体不完全的几率，减少载体自连和提高筛选成功率，强烈建议双酶切——后面一个切点只要距离第一个切点5个碱基以上就行（主要是给两个酶留出结合空间）。如果没有合适的酶切位点，根据选定插入位点设计引物，用反向PCR来获得线性化载体。在多片段组装克隆的世界里，凡是酶切搞不定的，统统PCR引物设计搞定。简单粗暴有效。

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Step 2

根据线性化载体两端的序列，设计目标片段的引物——划重点！这对引物外侧要有15-40碱基与载体两端分别同源，内侧要有15-20个碱基与目标片段同源。如果想要设计启动子SD序列跟ATG的距离，这就是好机会。合成引物不要超过65个碱基为好。

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Step 3

以这对引物PCR目标基因，就能得到两端与载体同源的目标片段。按比例混合片段和线性化载体，加入关键试剂——预混酶并在50度保温15-60分钟（因插入片段数量而略有不同，以操作手册为准）——以赛默飞的GeneArt™ Gibson Assembly® 克隆试剂盒系列为例，Gibson Assembly实际上是生命科学狂人文特尔（就是那个敢单挑6国合力的国际人类基因组计划还占尽上风，逼得当时美国总统出面协调让双方合作并同时发表结果的）东山再起后成立的Venter研究所旗下Gibson博士开发的，里面包含了精心优化搭配的三种酶活性：外切酶会外切双链末端而产生单链3’突出端，使得外源片段和线性化载体的互补末端能够退火，聚合酶活性会填补退火片段产生的缺口，连接酶活性能够在重组后进行连接。得到的产物是闭合载体，可以直接进入Step4了。

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Step 4

转化感受态细胞或者RCA了。还有的产品甚至连后面的聚合酶和连接酶都不需要，克隆效率一样高还能避免填补缺口时的意外错配，强的。

因为整个过程不会引入额外的碱基，可在预定位置精准插入外源片段，因此亦有无缝克隆，无痕克隆的美誉。这个方法还可以实现一步完成多个片段连续组装，只要设计PCR引物让相邻片段之间具有15-30个碱基的同源序列重叠，就可以实现单管一步反应，完成组装，而且还成功率高，保真度高，能大大减少重复筛选验证的工作量。

多片段连续组装如此简单易行，有越来越多应用之处——不单用于一般的多亚基/多调控元件/多蛋白表达载体构建、或者融合基因，还可以用于合成超大片段基因且成本低廉；甚至基因的多位点定点突变甚至改造DNA也能大显身手——只要在目标基因内分区并在设计PCR引物时引入突变位点或者改造序列就可以实现。

当然，不同的需求和应用：2-3个片段组装和15个片段组装、1-2kb和100kb片段组装，实际操作起来优化条件肯定不完全一样，甚至超长片段适用的转化菌株也跟普通菌株不一样（比如GeneArt EX超长版就建议用DH10B电转感受态细胞）。市面上有多种为满足不同需求而优化条件的商品化组装克隆试剂盒，可以根据自己的需求选出最合适自己需要的——选对合适的Kit，每天都是好心情，实验高歌猛进充满成就感；选不合适就只能天天re-search了——反反复复来来回回(re-)地摸索(search)尝试，挺折磨的。选择kit时一般留意几个参数：插入片段长度，单次反应可插入片段数量，同源序列长度——即合成引物时要求添加的载体同源序列长度，反应时间，当然还有克隆效率（几个领先品牌的产品说明都显示单片段插克隆效率>95%——片段越多效率会下降的）……市售产品中，是否包含感受态细胞，是否包含质粒纯化试剂或者PCR纯化试剂，都会影响产品单价。

后继的筛选验证工作同经典方法一样——抗性筛选，挑克隆扩增纯化，电泳+酶切或者PCR验证，最后挑几个最有可能的克隆去测序验证。如今分子克隆中的PCR一般都会选择高保真酶——出错率比Taq低得多、扩增长片段效果更好，要是几十kb还得是EX加长版高保真酶——相比后继测序验证的费用，这钱万万省不得的。

总而言之，基于同源序列的无缝组装克隆技术，相比经典分子克隆技术可谓飞跃提升，更为强大，更容易操作，适用性与设计灵活性更强，是值得深入了解的入门必备基础实验技能。回顾分子克隆技术的发展，亦可以体会到开放性思维如何从已知中推进技术发展，技术进步对我们日常实验、乃至对生命科学的认知会产生怎样翻天覆地的影响。