项目文章 | Nature子刊：新发1型糖尿病患儿肠道菌群的功能和代谢变化

迈博士有话说

本文应用了多组学（微生物+代谢组）的研究策略，为该类思路提供了讨论范例。同时，在有效结果的基础上，作者进行的双重验证。一是验证集，加强了结果的可靠性；二是小鼠粪便移植试验，证实了菌群在疾病确实通过代谢物发挥作用，确凿了结果的真实性。由此可见，充分的验证可以为我们的文章增色不少，同时，小鼠粪便移植实验的设计与讨论，此文不失为一篇较好的学习资料，供大家认真研读。

肠道菌群失调与1型糖尿病(T1D)有关；然而，T1D的微生物功能仍不清楚。针对此现状，复旦大学附属儿科医院罗飞宏课题组联合上海中医药大学季光课题组发表题为：Functional and metabolic alterations of gut microbiota in children with new-onset type 1 diabetes的文章，对队列中新发T1D儿童的肠道微生物功能和代谢改变进行了综合分析，该成果发表在Nature Communications上。迈维代谢为本文提供广泛靶向代谢组和靶向短链脂肪酸检测服务。

通过严格的病理诊断和排除过程，新发T1D儿童和非糖尿病对照(NC)受试者分别被纳入发现和验证队列。两组在年龄、性别、分娩和喂养方式上相匹配。由于体重指数较低，T1D组表现出较差的血糖控制和较低的C肽水平。与对照组相比，T1D组的全身炎症参数水平，包括白细胞(WBC)计数和中性粒细胞(NEUT)数量显著增加。此外，与NC组相比，T1D组显示高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平显著降低，甘油三酯(TG)水平升高。在验证队列中也获得了类似的发现(表1)。

首先分析T1D肠道微生物群的结构。PCoA显示，两组之间的微生物群落结构存在显著差异。T1D组的微生物群丰富性和多样性显著低于NC组(图1a，b)。还观察到T1D组中的组成差异增加，表明T1D个体中的群落结构比对照组中的更异质性(图1c，d)。在门水平上，T1D组的特征是Firmicutes显著低于NC组，Bacteroidetes和Proteobacteria高于NC组(图1e)。在属水平上(图1f)，T1D中的生物异常的特征是Firmicutes中许多产丁酸菌属减少，包括Faecalibacterium,Blautia,Lachnospira,Ruminococcus2和Roseburia，以及Bacteroides,Parabacteroides和Escherichia Shigella等扩展属。在验证组中检测到类似的T1D微生物群组成。此外，根据地理区域和疾病状态(是否患有糖尿病酮症酸中毒(DKA))进行了亚组分析，在发现和验证集中未发现总体细菌结构的显著差异。

利用随机森林分析，利用126个高度丰富的属构建了T1D最优分类器模型(图1g，h)。通过leave-one-out cross-validation筛选出一组22个属作为提供最佳判别力的关键属。这些关键属在发现集和验证集中曲线下面积(AUC)值分别为0.815和0.649(图1i)。

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Fig. 1 | The structural shift of gut microbiota in children with T1D

使用宏基因组测序进一步分析微生物群落结构。如网络分析所示，与NC组相比，T1D组中许多产丁酸菌(如Faecalibacterium prausnitzii, Eubacterium rectale和Roseburia intestinalis)的丰度降低。相比之下，许多机会性病原体，包括Escherichia coli, unclassified Enterobacteriaceae和Klebsiella pneumoniae，形成一个紧密的簇，并在T1D组中富集(图2a)。此外，NC组中各组物种形成的网络比T1D组更具互联性。根据随机森林模型，筛选出35种为T1D最易区分的物种。这些细菌种类被分成两类。聚类1主要由产丁酸菌组成，而聚类2主要由机会性病原体组成。Spearman对临床指标与鉴别物种的相关性分析显示，血红蛋白A1c (HbA1c)、空腹血糖(FBG)和TG水平与聚类1中的物种呈负相关，与聚类2中的物种呈正相关，而HDL-C则显示出相反的模式(图2b)。此外，代表全身炎症的指标，如WBC、NEUT和淋巴细胞(淋巴液)水平，与聚类1中的许多物种呈负相关。代谢参数与关键物种之间的多重相关性表明，肠道微生物群可能参与T1D葡萄糖代谢、脂质代谢和炎性反应的调节。

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Fig. 2 | The T1D-associated microbial species revealed by metagenomic analysis

粪便样本进行了宏基因组测序，进一步确定T1D肠道微生物群的功能特征。与NC组相比，T1D组的gene count (图3a)和Chao 1(图3b)及Shannon(图3c)指数均下降。PCoA显示组间的显著差异，其中T1D组的组成差异高于对照组(图3d，e)。根据KEGG显示，两组之间在功能水平上存在显著差异(图3f，g)。与对照组相比，检测到T1D组有27条上调途径和29条下调途径，主要涉及碳水化合物、氨基酸和核苷酸代谢。值得注意的是，与NC组相比，T1D组的淀粉和蔗糖代谢水平较低，且脂多糖(LPS)合成增加。

此外，T1D组中编码碳水化合物活性酶(CAZy)的基因的总丰度显著低于NC组(图3h，I)。值得注意的是，与NC组相比，T1D组中主要与淀粉、糖原、蔗糖、果糖代谢相关的最差异表达的CAZy基因均减少。以丁酸盐代谢为重点，进一步基于关于丁酸盐产生途径的数据库19进行比对，发现与对照组相比，T1D组中参与丁酸盐产生途径的大多数基因下调(图3j，k)。然后构建了Faecalibacterium prausnitzii的基因草图，丁酸盐代谢相关基因总丰度的13.58%，而在NC和T1D组中分别占基因总丰度的16.27%和10.35%(图3l)。此外，与NC组相比，T1D组与LPS合成相关的基因总丰度显著增加(图3m)。还发现与对照组相比，T1D组编码微生物胆汁盐水解酶(BSHs)和胆汁酸代谢的基因的总丰度显著降低(图3n-p)。总体而言，宏基因组分析显示，与对照组相比，T1D组中微生物功能特征紊乱，包括LPS生物合成增加，丁酸生成、碳水化合物代谢和胆汁酸代谢减少。

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Fig. 3 | Alteration of microbial functions in childrenwith T1D

进一步研究T1D肠道微生物群的生物学效应，使用粪便样本进行了代谢组学分析。与NC组比较，T1D组5种代谢产物(L-焦谷氨酸、蝶呤、5-羟色氨酸、N1乙酰精胺、3-(3-羟苯基)-3-羟基丙酸)含量显著升高，而甘胆酸、甘鹅去氧胆酸、dl苄基琥珀酸等21种代谢产物含量显著降低(图4a)。这些代谢产物属于11条代谢途径，主要与胆汁酸、碳水化合物、核苷酸、氨基酸代谢相关。3条途径显著富集:果糖和甘露糖、半乳糖和咖啡因代谢途径。还发现T1D组的粪便SCFAs、丁酸盐和乙酸的总浓度显著低于NC组(图4b，c)。此外，胰高血糖素样肽1 (GLP-1)(其分泌可被丁酸盐刺激)的血清浓度在T1D组中低于NC组(图4d)。与对照组相比，T1D组中成纤维细胞生长因子19 (FGF19)(肝胆汁酸合成的负反馈调节因子)的水平显著升高(图4e)。此外，LPS结合蛋白(LBP)水平和白介素-1β(IL-1β)，与NC组相比，T1D组中两者均显著升高(图4f，g)。

粪便代谢产物与临床参数相关性分析显示，T1D中富集的代谢产物(如蝶呤、N1-乙酰精胺和L-焦谷氨酸)的浓度与HbA1c、FBG和TG的血清水平呈显著正相关(图4h)。此外，T1D减少的代谢产物，如丁酸、乙酸和DL-苄基琥珀酸，与丁酸产生菌(包括Faecalibacterium prausnitzii,Eubacterium rectale和Roseburia faecis)呈正相关，但与条件致病菌呈负相关；然而，在富含T1D的代谢产物(如蝶呤和L-焦谷氨酸)中观察到了相反的情况。

此外，构建随机森林回归模型，使用关键细菌物种和粪便代谢产物的组合来筛选T1D相关生物标志物。关键的35种细菌和28种粪便代谢产物的组合分析显示，一组9种细菌和9种粪便代谢产物提供了最好的辨别能力(图4i)。值得注意的是，与单独使用微生物群生物标志物相比，细菌物种和粪便代谢物的组合标志物在发现集(AUC值从0.815增加到0.976)和验证集(AUC值从0.649增加到0.809)中对T1D的辨别能力都有很大提高(图4j)。因此，联合分析可优化T1D鉴别的准确性，联合生物标志物可为制定基于微生物群的T1D预防和干预策略提供新的见解。

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Fig. 4 | Aberrant fecal metabolic patterns in children with T1D

为了评估T1D中肠道微生物群与血糖控制恶化之间的因果关系，将肠道细菌从T1D患儿和健康儿童移植到抗生素治疗的小鼠中(图5a)。在没有外部刺激的情况下，与对照组(FMTNC)相比，T1D相关小鼠接受者(FMTT1D)表现出较高的空腹血糖水平(图5b)。胰岛素耐受试验还显示，与对照组相比，FMTT1D组在胰岛素激发30 min后葡萄糖水平显著升高，表明胰岛素敏感性降低(图5c)。有趣的是，补充丁酸盐消除了由不同肠道微生物群诱导的FBG水平差异，并显著改善了胰岛素抵抗(IR)。在口服葡萄糖耐量试验(OGTT)的结果、胰岛素和C肽水平以及胰腺组织的组织学结构方面，各组之间未检测到差异。

然后，检测TLR4、MyD88和（p-NF-κB）p65的肝表达，以评估全身炎性反应。与FMTNC组比较，FMTT1D组TLR4和MyD88肝相对表达量明显升高，p-NF-κB/NF-κB比值也升高；然而差异无统计学意义(图5g–j)。与对照组相比，FMTT1D组中促炎细胞因子IL-1β的血清水平也显著升高(图5k)。因此，这些数据表明，T1D相关的肠道微生物群可能诱发炎症和糖尿病的早期症状。

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Fig. 5 | Disturbed glucose homeostasis induced by the transplantation of T1Dassociated gut microbiota

最后，在STZ诱导的T1D小鼠中探索了特定细菌代谢产物丁酸盐和LPS的作用(图5a)。在T1D小鼠模型中，丁酸盐口服给药发挥了抗糖尿病作用，与未治疗的T1D小鼠相比，OGTT和ITT的FBG、葡萄糖水平和HbA1c值显著降低就是证明(图6a-d)。值得注意的是，与模型组相比，丁酸盐治疗组的血清C肽水平(T1D的关键诊断标准之一)显著升高(图6e)。与模型组的小鼠相比，在丁酸盐处理的小鼠中也观察到血清胰岛素水平升高，尽管没有观察到统计学差异。相反，与模型组相比，LPS组显示OGTT和ITT的FBG和葡萄糖水平升高，血清C肽水平降低(图6f-j)。

然后评估胰岛功能。HE染色和胰腺切片免疫组化分析显示，与T1D小鼠相比，丁酸盐治疗减轻了STZ诱导的胰岛病变，胰岛数量和总胰岛素阳性胰岛数量增加。与模型组相比，LPS治疗组胰岛数量较少，胰岛结构损伤较多(图6k-m)。此外，在丁酸盐治疗组，促炎细胞因子IL-1β减少(尽管差异不显著)，而LPS显著增加IL-1β的分泌(图6n，o)，可能对胰岛结构和功能造成炎性损伤。总之，这些发现表明丁酸盐可减轻胰岛损伤并保留功能性β细胞，而LPS可进一步加重糖尿病小鼠的胰岛损伤和功能障碍。

为了探索其生物学过程和潜在机制，通过RNA测序分析胰腺对丁酸盐和LPS的转录反应。LPS治疗组显示出与其他三组不同的谱。将这四组中鉴定出的625个差异表达基因(DEGs)分为三组(图6p)。簇1主要由代谢途径相关基因组成，在对照组和丁酸组中显著富集。簇2主要由与免疫和刺激反应相关的途径组成，与其他组相比，LPS处理组中这些途径被特异性上调。簇3主要由与生物学过程相关的途径和信号通路组成，在模型组和LPS处理组中富集(图6q)。

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Fig. 6 | Roles of butyrate and LPS in STZ-induced T1D mice

最后，通过组间成对比较确定了DEG。在第1组中，主要关注关键的前胰岛素原基因胰岛素(Ins) 1和Ins2。与免疫组织化学分析结果一致，丁酸盐治疗组Ins1和Ins2表达显著升高，而LPS治疗组低于模型组(图6r)。然而，与模型组相比，簇2中NOD样受体信号通路(Il1b、Il6、Il18和Caspase 1)和TLR信号通路(Tlr2、Tlr4和Tlr6)的代表性基因在LPS组中上调，但在丁酸盐组中下调(图6s，t)。KEGG通路富集分析显示，与模型组相比，与炎症和免疫反应相关的通路，包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路和磷脂酰肌醇3-激酶-Akt信号通路，在LPS治疗组主要上调，在丁酸盐治疗组下调。与模型组相比，丁酸盐治疗组中与胰岛素信号通路相关的通路和内分泌抵抗被显著下调(图6u，v)。

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Fig. 7 | Schema summarizing key findings

深入的多组学分析显示，T1D肠道微生物模式改变，涉及丁酸代谢、LPS生物合成和胆汁酸代谢。作为肠道生物标志物的18种细菌和粪便代谢产物的组合很好地区分了T1D与对照。动物实验进一步揭示了T1D肠道菌群是调节糖代谢的致病因素。在T1D小鼠模型中，丁酸盐和LPS分别对胰岛结构和功能产生保护作用和破坏作用。

本多组学研究和动物实验扩展了我们对T1D微生物功能和代谢异常的见解，表明特定肠道细菌和代谢产物可作为T1D新的辅助诊断、预防和治疗靶点。

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