项目文章 | IF=6.314，TM广靶单组学轻松发文思路挖掘颅内动脉瘤破裂标志物

迈博士有话说

✦在动脉瘤领域，首次用TM广靶技术（市面上检测最全面的产品）对肿瘤状态的好坏进行代谢组层面的探索；

✦并运用了较新的机器学习算法（迈维代谢提供），发现了比现在临床准确性更高的标志物结果，且结果很好；

这主要是由于先进的代谢物扫描技术，使得研究者可以从更多新物质中挑选最好性能的代谢物，单组学的分析也较为简单。

Tips：本文样本数量不多，但行文思路流畅。因此很适合临床新手借鉴，这种贴近临床的研究，更有希望日后向临床转化，适合新晋的青年医生们。

 ● 期刊：Clinica Chimica Acta

 ● 影响因子：6.314

 ● 发表时间：2022.11

颅内动脉瘤(IAs)是一种异常的肿块，起源于颅内动脉壁，影响约3-5%的成人血流。尽管IAs是一种世界范围内普遍存在的脑血管疾病，但目前还没有被批准的生物标志物来评估疾病进展。此外，IAs的隐匿过程可能导致早期误诊的倾向。动脉瘤第一次破裂的死亡率为30%-40%。再破裂动脉瘤的死亡率可达60%-70%，给患者、家庭和社会带来负担。目前颅内动脉瘤的诊断严重依赖于影像学技术，而对高危动脉瘤的临床评估很大程度上依赖于临床医生的经验，主要根据临床因素、血流动力学和IA的形态。此外，IA的早期诊断和风险评估尚缺乏经过验证的生物学标记物，难以进行大规模筛查。而且，一旦发现未破裂颅内动脉瘤后，最佳的治疗方案仍有争议。在这方面，开发有助于IA早期诊断和IA破裂预测或分类的生物学特征具有巨大的价值。

近年来，血浆代谢物作为潜在的生物标志物受到了广泛关注，已成为IA研究的一个新兴领域。既往研究发现未破裂颅内动脉瘤(UIA)患者体内氨基酸和脂肪酸代谢异常，提示血浆代谢物与UIA密切相关。然而，针对氨基酸和脂肪酸的靶向研究只关注较少的代谢物，不能全面反映不同IAs状态的整体代谢。此外，广泛靶向的代谢组学很少用于发现IA早期诊断和破裂风险评估的生物学标记。TM-广泛靶向代谢组学可以监测成百上千的通过动态多反应监测代谢产物，将非靶向和靶向代谢组学具有灵敏性高、特异性高、量化能力好的优点。因此，我们假设使用这种新方法可以在对照组、UIA和RIA患者中识别血浆代谢物的显著差异。

本研究旨在使用广泛靶向的代谢组学方法描述IA患者血浆代谢特征的图谱，并比较IA患者不同状态之间的差异。此外，为了探索新的IAs生物标志物，采用基于机器学习最小绝对收缩和选择算子(LASSO)和随机森林的分类器建立IAs诊断模型和破裂识别模型。此外，本研究还旨在探讨不同代谢物的潜在生物学功能和代谢途径，为IA及其破裂的新的诊断、预防和治疗策略提供线索。通过对105名参与者(包括30名对照组和75名IA患者)的血浆样品进行差异代谢物分析，作者发现代谢谱的组成随IAs的严重程度发生了显著变化。作者用综合机器学习策略建立的两个模型都能有效地区分动脉瘤的状态。受试者工作特征曲线(ROC)显示出较强的预测能力。作者的发现强调了特异性代谢物作为IA的早期诊断和风险评估工具的作用。

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图1 颅内动脉瘤生物标志物发现的研究设计和工作流程

UIA =未破裂颅内动脉瘤;RIA =颅内破裂动脉瘤;TOF =飞行时间;MRM =多反应监测;PCA =主成分分析;OPLS- DA = 正交偏最小二乘判别分析;LASSO =最小绝对收缩和选择算子;ROC =受试者工作特征。

首先，为了鉴别与动脉瘤相关的代谢产物，我们将重点放在UIA和对照组之间的差异代谢产物上。使用OPLS-DA模型，分类结果显示UIAs和对照组之间的所有血浆代谢物都有显著分离(图2A)。接下来，我们根据两组代谢物的折叠变化进行单因素T检验分析，得到19个p-value < 0.05 (FDR < 0.1)，VIP > 1的代谢物，其中11个代谢物减少，8个代谢物增加,如火山图所示(图2B)。相比之下，top foldchange代谢物结果表明，氨基酸及其代谢组学的丰度上调。同时，苯和核苷酸的一些衍生物，如腺苷，在UIAs中普遍下降(图2C)。差异代谢物KEGG途径富集分析显示，膦酸盐和膦酸盐代谢是最高的危险因素。显著干扰的代谢途径主要有谷胱甘肽代谢、氨基酸生物合成和辅因子等9条(图2d)。

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图2 未破裂动脉瘤患者与健康人的代谢差异

(A) UIA患者和对照组受试者的OPLS-DA评分图。(B) UIA患者和对照组的火山图。log2FC > log21.2或< -log21.2，-log10FDR > 1被认为是显著的。(C) UIA患者和对照组参与者之间显著不同代谢物的条形图为log2FC。(D) UIA患者和对照组的KEGG富集泡图。

代谢谱数据的OPLS-DA模型显示，IAs患者不同状态的血浆代谢产物总体差异显著(图3A)，提示这两个疾病分期在分子水平上具有不同的代谢谱。通过单变量分析，鉴定出了172个RIAs和UIAs之间的差异代谢物，其中69个上调，103个下调(图3B)。下调变化代谢物主要包括各种次生胆汁酸，如糖基脱氧胆酸、甘氨酸脱氧胆酸等(图3 c)。这些差异代谢物在亚油酸代谢、血管平滑肌收缩、脂肪酸代谢、膦酸盐和膦酸盐代谢、逆行内源性大麻素信号通路和血清素能突触6个高危因子通路富集(图3D)。

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图3 鉴别破裂颅内动脉瘤(RIA)患者和UIA患者的代谢谱

(A) RIA患者和UIA患者的OPLS-DA评分图。(B) RIA患者和UIA患者的火山图。log2FC > log21.2或< -log21.2，-log10FDR > 1被认为是显著的。(C)以log2FC表示的条形图RIA患者和UIA患者之间代谢物有显著差异。(D) RIA患者和UIA患者的KEGG富集泡图。

在系统地定义了与UIA和RIA相关的代谢组学概况和途径后，我们开始通过选择可用于预测UIA存在和区分RIA与UIA的代谢物来建立诊断模型。经初步统计筛选得到的代谢物仍然众多(p < 0.05, FC > 1.2)。为了进一步缩小生物标志物候选范围，作者应用了一种变量选择方法来筛选重要的代谢物。变量选择是通过统计分析方法，从大量的自变量中选择出一组对因变量具有较强解释力的自变量，是统计推断的重要组成部分。在这里，所有样本按2:1的比例随机分为训练集和验证集。使用LASSO和Random Forest来鉴定代谢物，然后它们的交叉点是候选的代谢物，作为最佳的生物标记物。

为了提高预测性能，避免过拟合和假阳性，作者对训练集进行了500次特征选择和10次交叉验证。基于最优生物标志物，使用Logistic回归进行最终模型构建，并通过ROC曲线的AUC值和验证集的预测精度进行评估(图4A)。通过利用上述机器学习策略，我们确定了一个诊断面板来预测UIA的存在(UIA与对照)，其中包含6种代谢物(称为M6)，包括n -乙酰-l -亮氨酸、卟啉胆素原、水杨酸乙酯、乙酰胺、n6 -甲基腺嘌呤和1-甲基腺嘌呤。诊断模型将UIA与对照区分开，训练集的AUC为0.9(图4B)，验证集的AUC为0.843(图4C)。

通过散点图来渲染模型的预测效果，以评估机器学习策略的可靠性，结果表明，在验证集上，不同样本能够正确分类，准确率高达19/24(图4D)。作者进一步探讨了鉴别IA患者(RIA和UIA)不同状态的可能性。在两种机器学习方法中具有相似性能的最佳生物标记物或破裂预测模型由5种代谢产物(命名为M5)组成，包括glyco -脱氧胆酸、5,6-二甲基苯并咪唑、尿嘧啶、儿茶酚和N-(1-脱氧-1-果糖)苯丙氨酸。区分UIAs和UIAs的破裂预测模型在训练集的AUC为0.99(图4E)，在验证集的AUC为0.929(图4F).

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图4 预测UIA存在和区分RIA与UIA的潜在生物标志物面板

(A)综合机器学习方法识别生物标志物的工作流程。

(B)训练集中鉴别UIAs患者和对照组参与者的潜在血浆代谢物生物标志物的ROC曲线;

(C)验证集中鉴别UIAs患者和对照组参与者的潜在血浆代产物生物标志物的ROC曲线;

(D)散点图显示模型在区分UIA患者和对照组参与者方面的预测性能。在训练集和验证集数据的基础上，使用逻辑回归建立最优生物标志物模型。横坐标为样本的实际群体，纵坐标为模型预测样本群体的可能性。虚线是0.5的极限值。

(E)训练集中鉴别RIA患者和UIA患者的潜在血浆代谢物生物标志物的ROC曲线。

(F)验证集中鉴别RIA患者和UIA患者的潜在血浆代谢物生物标志物的ROC曲线。

(G)散点图显示模型在区分RIA患者和UIA患者时的预测性能。

最后，诊断模型中M6的丰度在训练集和验证集上都具有统计学意义，暗示它们可能作为区分UIA的生物标志物(图5A)。而破裂预测模型中的大多数生物标记物也表现出一致的显著性差异，但糖苷脱氧胆酸和5,6-二甲基苯并咪唑在RIA有效性验证组中仅呈现下降趋势(图5B)。

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图5 训练和验证集中潜在生物标志物的相对含量变化

(A) UIAs患者和对照组中M6生物标志物的箱线图。(B) RIA患者和UIA患者中M5生物标志物的箱线图。

在此，作者进行了一项TM-广泛靶向代谢组学研究，系统地定义IA发生过程中的代谢概况和相关途径。代谢组学分析显示，与对照组相比，UIAs患者的代谢途径有显著的9种之多，其中谷胱甘肽代谢变化最为显著。此外，两种途径似乎在从UIA到RIA的进展中起着至关重要的作用。此外，作者开发了综合生物标志物发现策略，进一步选择和结构验证两组基于6和5代谢产物的生物标志物组合，使用两种机器学习算法(LASSO和随机森林)对UIA及其破裂进行分类，具有潜在的临床应用价值，这是一种越来越被认为是评估和预测疾病状态的有效方法。

血浆生物标志物panel将UIAs与对照组区分开来，其表现非常出色，训练集的AUC为0.9，验证集的AUC为0.843。更重要的是，作者开发了一个基于5种代谢产物的预测模型来区分RIA患者和UIA患者，其有效性很高：训练集和验证集的AUC分别在0.99到0.929之间。

作者的研究结果强调了特异性代谢物作为IA的早期诊断和风险生物标志物的作用并且选择的代谢物具有良好的诊断和预测能力。ROC曲线表明，潜在的生物标志物panel可用于IAs的诊断和破裂风险评估。

TM广靶代谢组学结合了通过对样本先进行非靶全扫描，达到对样品扩库的作用，再通过广泛靶向代谢组学MRM黄金定量模式对代谢物进行定量，通过迈维自建标品数据库对代谢物进行定性，具有定性定量准，通量更高的特点。技术原理如下图：

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