热点应用丨小鼠肠道组织切片“全息”成像——拉曼光谱多光子成像

双光子荧光(2PEF)和二次谐波(SHG)是研究生物样品方面的多光子成像技术。两种成像技术都利用飞秒脉冲红外激发光产生较短波长的光来对样品进行成像，通过不同的物理过程实现（图1）。在2PEF中，两个红外光子同时被荧光团吸收，使其进入激发态，然后辐射弛豫，发射较短波长的荧光。相比之下，SHG不是吸收和发射过程，而是两个红外光子结合在具有特定对称性的非线性光学材料中，产生恰好是入射光子一半波长的新光子。这两种技术都利用红外光的较低散射和吸收，来实现深入组织的成像。在本文中，天美爱丁堡仪器公司的RMS1000共焦显微拉曼光谱仪，使用2PEF和SHG对小鼠肠道的组织切片进行成像。

图1 双光子荧光 VS 二次谐波

使用RMS1000的CCD相机对小肠组织切片进行光谱成像。

图2 （a）用Alexa Fluor®568染色的小鼠肠道切片的2PEF和SHG图像

（b）从图像中选取两点的光谱图

通过双光子荧光寿命成像可以获得更多的信息。对于寿命成像，使用脉冲选择器将激光的频率降低到20 MHz，以确保脉冲之间的完全荧光衰减。利用光子计数混合光电检测器上的TCSPC，采样相同的900μm x 800μm区域，并记录了每个点的荧光衰减。使用RMS1000 Ramacle^®软件对每个荧光衰减进行指数模型拟合，得到的寿命图像如图3a所示。寿命图像显示，与绒毛相比，肠壁附近的肠隐窝的荧光寿命降低；这是一个可以从寿命成像中获得更多样本信息的例子。

图3 （a）用Alexa Fluor^®568染色的小鼠肠切片的2PEF寿命图像

（b）从图像中选取两点的荧光衰减

采用RMS1000共聚焦显微拉曼光谱仪的多光子显微成像技术，可以对小鼠肠道切片样本进行成像。RMS1000配备一个外部飞秒激光器和TCSPC，用于先进的光谱和时间分辨的多光子成像技术，如2PEF和SHG，增强了拉曼成像的核心能力。