RNA修饰的内源性编辑(m6A,m1A,m5C)——通用型设计思路

RNA修饰是近几年表观转录组学的热门，迄今已发现了170多种RNA化学修饰，调节了多种RNA功能，如剪切、稳定性、结构、翻译等。

当前，研究者多以测序确认分子有无发生RNA修饰，但无法直接证明，细胞功能的变化与对应分子有直接关联，这为研究的进一步展开提出了痛点。得益于分子生物学的发展，尤其是CRISPR的出现，这一问题得以迎刃而解，今天小编以m6A为例，给大家介绍RNA修饰内源性编辑的思路。

m6A是真核生物mRNA上含量最丰富的化学修饰，由甲基转移酶复合物（包含METTL3,METTL14,WTAP,KIAA1429,RBM15,RBM15B）催化产生，可被去甲基化酶ALKBH5或FTO去除。这是第一步，需要知道对应RNA修饰的写入器（Writer），我们的目的是将这个Writer拉至目标位点处，从而改变位点的修饰情况。那么，怎么定位过去呢？

CRISPR的出现，为基因编辑提供了简单、有效的工具，助力生物学的研究。为研究者熟知的是CRISPR/Cas9，是直接靶向DNA的一类核酸酶分子。今天的主角是RNA，因此需要用到后发现的Cas12/13分子（Cas13目前使用频率最高，分为Cas13b，Cas13d），它们是能够依靠crRNA与目的RNA结合并切割的，原理与Cas9是类似的，只是靶标分子换成了RNA。对其核酸酶活性位点突变，使其无法切割RNA，称dCas13，只能行使靶向作用。

随后，我们将dCas13与Writer（一般是催化结构域）融合，借助crRNA的定位达到特异性编辑目标位点的效果。 

Wang¹等人基于此原理，将ALKBH5与无活性dCas13b融合：

选择细胞色素b5型A（CYB5A）研究去甲基化作用，分别在5UTR、编码区CDS、3UTR设计靶点，野生型Cas13b导致基因表达水平下降（图D），说明三个靶点都能靶向CYB5A；dCas13b-ALKBH5导致两组细胞均出现m6A编辑的下调（图E），而ALKBH5 H204（无催化能力）未出现去甲基化效果（图F），dCas13b-ALKBH5处理之后的CYB5A丰度都出现了下降（图G、H），且CYB5A mRNA和YTHDF2（m6A的解码器）之间的结合明显减弱，说明了dCas13b-ALKBH5有效去除了CYB5A的甲基化修饰。

不同于DNA主要定位细胞核，RNA的分子定位是多样的，相当一部分比例的RNA定位细胞核，对应的修饰如何做呢？LI²等人同样基于CasRx（又名RfxCas13d）,与m6A去甲基化酶FTO融合，并额外加了NLS核定位信号，即可将该去甲基化修饰系统转移至细胞核，从而调控核RNA分子的修饰。作者针对TFF1e设计gRNA，在MCF7细胞表达dCasRx-FTO，显示出m6A水平降低（图3E），阅读器YTHDC1的下拉实验同时证明了m6A修饰的降低，作为对照，不相关的GREB1e RNA不受影响（图3E和3F）。

CRISPR的伟大之处，不仅仅在对基因的直接编辑上，突变型的dCas偶联不同的修饰分子，可以达到不同的效用，如DNA甲基化修饰（偶联DNMT3A,TET1）、组蛋白乙酰化修饰（偶联P300,LSD1），加之今天提到的m6A修饰。最近比较火的m1A，m5C等也可以按照此结构进行内源性编辑，只需要明确其修饰分子即可。吉凯基因长期为研究者提供前沿的分子工具，快来咨询吧！！！

【参考文献】

1.Targeted mRNA demethylation using an engineered dCas13b-ALKBH5 fusion protein

2.Enhancer RNA m6A methylation facilitates transcriptional condensate formation and gene activation