2022-11-25 16:42:02 东曹(上海)生物科技有限公司
重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白(rIFNα2b-HSA),是由人干扰素α2b和人血清白蛋白2种编码基因通过基因工程技术构建的毕赤酵母工程菌,通过诱导表达产生的胞外分泌蛋白。干扰素类重组蛋白药品是目前临床上广泛用于治疗乙型肝炎、丙型肝炎等顽症的有效药物。2015年版《中华人民共和国药典》对重组蛋白制品的纯度要求为不低于95.0%。
本次分享的应用中,作者采用离子交换色谱柱TSKgel Q-STAT建立了测定重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白药物纯度的方法,经验证该方法适合rIFNα2b-HSA纯度检测。
溶液配制
供试品溶液:采用水稀释供试品成质量浓度为1 mg/mL的溶液。
专属性验证样品溶液:取供试品0.5 mL,加入0.8 mol/L氢氧化钠溶液30 μL,置于摇床上,200 r/min摇动10min,用5%磷酸溶液中和,用水稀释2倍,按上述方法进样。
分析条件
色谱柱:TSKgel Q-STAT(4.6 mmI.D.×10 cm)
流动相A:20 mM Tris-HCl (pH 8.5)
流动相B:20 mM Tris-HC+0.5 M NaCl (pH 8.5)
梯度洗脱:0~3 min, 100%A; 3~18 min, 100%A-0%A; 18~21 min, 0%A; 21~22 min, 0%A-100%A
流速:0.5 mL/min
进样体积:20 μL
柱温:25℃
检测器参数:UV@214 nm&280 nm
分析结果
图1 离子交换色谱法系统适用性试验结果
(蓝色为214 nm;棕色为280 nm)
图2 例子交换色谱法专属性试验结果
(蓝色为214 nm;棕色为280 nm)
图3 浓度与峰面积线性关系图
表1 三种纯度测定方法检测结果的比较(%)
结果与讨论
采用TSKgel Q-STAT色谱柱建立的重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白纯度测定方法 (见图1),主成分峰在 214 nm 处响应值较280 nm 处更好,故采用 214 nm 作为该方法的检测波长。供试品经碱破坏后,其降解产物色谱峰与主成分峰能有效分离 (见图2),表明方法专属性良好。
线性考察结果见图3,在浓度范围0.05~1.0 mg/mL范围内,样品浓度与峰面积,线性关系良好 (R2=0.9974);精密度测试结果,RSD为0.52% (n=6);定量检测限为0.0018 mg/mL (S/N=10);与反相色谱法、电泳法的对比检测结果见表1,纯度结果均大于95%。
以上结果均符合 2015 年版《中华人民共和国药典》对实验方法的验证要求 ,可以作为重组人血清白蛋白与干扰素α2b融合蛋白的纯度检测方法之一。
参考资料:
1. 杜莹莹, 武福军, 韩浩, 张亚男, 刘志向敏 离子交换色谱法测定重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白纯度. 药物分析杂志. 2020,40(8):1490-1493
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