应用分享|重组人生长激素Fc免疫融合蛋白含量的SEC-HPLC测定

2024-02-20 16:42:40 东曹(上海)生物科技有限公司


重组人生长激素 (recombinant human growth hormone,rhGH) 主要用于治疗儿童及成人身材矮小,发育迟缓等病症。rhGHFc免疫融合蛋白是将rhGH基因与特异位点突变后的人抗体IgG4 Fc段用柔性linker连接,利用CHO-k1细胞进行表达。

本应用中作者采用了尺寸排阻色谱柱TSKgel G2000SWXL建立了测定重组人生长激素Fc免疫融合蛋白含量[1]。

01

溶液配制

1) 样品溶液配制:标准品溶液的配制取GH标准品1支 (蛋白含量为1 mg),精密加入注射用水1.0 mL溶解,制成浓度为1.0 mg/mL的标准品溶液。

2) 标准曲线溶液配制:取rhGH­Fc免疫融合蛋白样品,经Lowry法测定蛋白浓度约为3.07 mg/mL,用注射用水稀释,配制成以下6个浓度: 0.307、0.614、0.860、1.228、1.596、1.842 mg/mL。

02

分析条件

色谱柱:TSKgel G2000SWXL(7.8 mmI.D.×30 cm, 5 μm)

流动相:0.05 mmol/L磷酸盐缓冲液+0.3 mol/L氯化钠(pH到6.8)

流速:0.6 mL/min

进样体积:100 μL

柱温:45℃

检测器参数:UV@280 nm

03

分析结果

图1  rhGH-Fc样品、rhGH-Fc对照品、GH对照品及蛋白缓冲叠加色谱图(A: 样品、B: 对照品、C: GH国家对照品;D: 蛋白缓冲液(50 mmol/L磷酸盐缓冲溶液) )

图2  峰面积与浓度线性关系图

04

结果与讨论

采用TSKgel G2000SWXL建立的重组人生长激素­Fc免疫融合蛋白含量测定方法,分离谱图见图1,rhGH­Fc免疫融合蛋白样品与对照品出峰时间一致,GH国家标准品与对照品出峰时间不同,蛋白缓冲液不出峰,表明方法专属性良好。

线性考察结果见图2,在浓度范围0.307~1.842 mg/mL范围内,峰面积与样品浓度,线性关系良好 (R2=0.9994),平均回收率在91.0%~100.4%之间,表明该方法准确度良好。该方法的定量限为:6.0 µg/mL。

综上所诉,利用SEC-HPLC进行蛋白含量检测比Lowry法更加灵敏高效,可缩短检测时间。该方法系统适用性、专属性、精密性良好,准确性较高,有利于为纯化工艺提供数据支持。

参考文献

1. 马陌,孙瑞欣,王江林,刘冰莹,刘景会. 重组人生长激素-重­Fc免疫融合蛋白多聚体含量尺寸排阻高效液相色谱检测方法的优化及验证. 中国生物制品学杂志. 2023,36 (10):1235-1241.

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