2022-11-09 14:01:40, 丹纳赫生命科学 SCIEX
背景
近年来,人们对环状RNA(circRNA)的兴趣日益浓厚,因为它们除了具有生物标志物潜力外,还涉及许多生物过程和疾病。
然而,一开始circRNA并没有得到科研人员的重视,这是为什么呢?
1971年,科研人员在研究马铃薯纺锤块茎病时,发现了类病毒。区别于病毒,类病毒没有蛋白质外壳包被,而且它的基因组是单链闭合的RNA分子。
1979年,通过电子显微镜,研究人员观察到真核细胞的细胞质中存在圆环形RNA。
(图片来源:Hsu and Coca-Prados, 1979)
但是,由于早期的RNA文库制备常使用poly A富集的方式,而circRNA没有游离的5’和3’末端,导致大量circRNA的信息被遗漏。所以,在随后的几十年里,circRNA并没有引起研究人员的太大关注,一直被认为是错误剪接的结果。
随着21世纪RNA-seq技术和生物信息学的发展,大量circRNA相继得到鉴定,同时还发现了circRNA的更多功能。
(图片来源:可画)
环状RNA与线状RNA从本质上有什么不同?为什么说环状RNA更具研究价值呢?
与线状RNA的区别
1
剪接方式
经典线状RNA的剪接方式:从最初转录产物中除去内含子,并将外显子连接起来,形成一个连续的RNA分子。成熟的线状RNA具有5’端帽子结构和3’端poly A尾巴。
环状RNA的剪接方式:通过RNA特异性反向剪接,后面外显子的尾端与前面外显子的前端相连,形成不具有5’端帽子和3’端poly A尾巴的共价闭合环状结构,通常由一个以上外显子构成,部分包含内含子。
2
稳定性
核酸酶一般通过识别线状RNA分子的末端发挥作用,而circRNA没有5’和3’末端结构,因此circRNA不会被RNA酶和核酸外切酶降解,使得circRNA比线状RNA具有更长的半衰期和更高的稳定性。
由于circRNA更稳定,大部分circRNA在胞浆中富集,其丰度甚至可以达到相应线状RNA的十余倍。并且大多数外显子circRNA的半衰期超过48h,而mRNA的平均半衰期为10h。
所以,circRNA比线状RNA在细胞中的表达量更高,表达时间更长。除了可以在体内长效稳定表达外,circRNA药物还能重复给药,且能够通过多种给药途径用药。
(图片来源:可画)
3
翻译蛋白质
尽管大部分circRNA为非编码RNA,仍有少数circRNA被证实具有编码蛋白质的功能。
早期研究表明circRNA存在内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)顺势调控元件,这个元件能够被核糖体识别,使得circRNA具有翻译蛋白的功能。
近年有研究发现,在没有任何特定的IRES元件的情况下,含有无限开放阅读框的合成circRNA可以在活的HeLa细胞中通过滚环扩增(RCA)机制,有效翻译出不同大小的蛋白质产物。甚至还可以利用有限的核苷酸序列翻译出更大分子量的蛋白质,这些是线状mRNA无法实现的。
以上这些发现为未来circRNA的研究提供了新的方向,可以为疾病诊断和预后提供新的潜在生物标志物。由于circRNA高度稳定、编码抗原表达量高、适应性广等优点,已有国内研究团队针对新冠病毒及其突变株开发出了环状RNA疫苗。
另一方面,有学者提出并论证了:绝大多数(>97%)circRNA来自于错误剪接的无功能或有害产物,这一“分子错误”假说。但这一论断并不直接否定对于circRNA的生物学功能,而是从系统层面理清了circRNA的生物学地位。
功能性研究解决方案
目前,circRNA的发生和作用机制尚未完全明确,其在生命活动中发挥的作用以及分子机制还需要进一步的深入研究。丹纳赫生命科学关注circRNA研究的需求,提供circRNA功能性研究解决方案。
NGS建库
想要研究circRNA首先要筛选出目标circRNA,可通过简单的RNase R预处理,将线性RNA消化,然后进行RNA建库。丹纳赫生命科学旗下IDT两款RNA建库试剂盒——xGen RNA 文库制备试剂盒与xGen Broad-Range RNA文库制备试剂盒助力转录组表达谱分析,具有以下优点:
100pg-100ng 起始RNA建库,满足不同样本起始水平
单链接头连接,无二聚体产生风险
无需优化接头的稀释浓度
CRISPR/Cas9基因编辑系统
为了明确circRNA在通路中的作用,常用CRISPR-Cas基因组编辑系统来进行敲除/敲入基因序列的研究,IDT Alt-R CRISPR基因编辑系列产品提供以下服务:
提供CRISPR-Cas9与CRISPR-Cas12a等多种基因组编辑解决方案,适配更广泛的实验需求
Cas9 crRNA与tracrRNA、Cas12a crRNA合成服务,可简易在线定制
搭配Alt-R CRISPR蛋白,有效提高靶向率,相比质粒诱导方法更准确
更小的细胞毒性,引发的先天性免疫应答更低,安全性更高
蛋白质水平分析
circRNA翻译成蛋白质后,需要对蛋白质进行定性和定量分析。
丹纳赫生命科学旗下SCIEX的高分辨质谱ZenoTOF™ 7600 系统:创新多重碎裂技术及更高灵敏度,融合定性的灵活性与定量功能,助力circRNA编码蛋白质的定性分析。
SCIEX 7500 系统:可使样本的定量灵敏度达到新高度,精准定量目标circRNA编码蛋白质。
参考资料:
许妍, 赵雪, 堵晶晶, 杨琼, 杨大洪, 蒲红州, 张顺华, 朱砺. 环状RNA研究进展[J]. 中国生物工程杂志, 2017, 37(10): 93-102.
张潆月, 马月辉, 赵倩君. 环状RNA的研究进展. 生物技术通报, 2017, 33(7): 29-34.
parraguirre L, Prada-Luengo I, Regenberg B and Otaegui D. To Be or Not to Be: Circular RNAs or mRNAs From Circular DNAs? Front. Genet. 10:940 (2019).
Meng, S., Zhou, H., Feng, Z. et al. CircRNA: functions and properties of a novel potential biomarker for cancer. Mol Cancer 16, 94 (2017).
Abe, N., Matsumoto, K., Nishihara, M. et al. Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells. Sci Rep 5, 16435 (2015).
Liang, Q., Zongyi, Y., Yong, S. et al. Circular RNA Vaccines against SARS-CoV-2 and Emerging Variants. Cell 185, 1728–1744 (2022).
Xu C, Zhang J. Mammalian circular RNAs result largely from splicing errors[J]. Cell Reports, 2021, 36(4): 109439.
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