EPR课堂 | 电子-电子双共振技术在DNA结构解析中的应用

自20世纪50年代，Watson和Crick提出经典的DNA双螺旋结构以来，DNA就成为了生命科学研究的核心。DNA中4种碱基的数目及其排列顺序会导致基因的多样性，其空间结构也会影响着基因的表达。

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除了传统的DNA双螺旋结构，研究发现在人类细胞中还存在着一种特殊的四链DNA结构——G-四链体。G-四链体（G-quadruplex）是由富含串联重复鸟嘌呤（G）的DNA或RNA折叠形成的高级结构，在迅速分裂的细胞（例如癌细胞）中G-四链体的含量特别高。因此，G-四链体可作为抗癌研究中的药物靶点。研究G-四链体的结构及其与结合剂的结合模式，对于癌细胞的诊断与治疗具有重要的意义。

G-四链体的三维结构示意图。图片来源：wikipedia

脉冲偶极电子顺磁共振（Pulsed Dipolar EPR，PDEPR）方法已经发展成为结构和化学生物学中可靠和通用的结构测定工具，通过PDEPR技术可在纳米尺度上提供距离信息。在G-四链体结构研究中，使用电子-电子双共振（electron-electron double resonance，DEER）技术结合定点标记（site-directed spin labeling，SDSL）技术可区分不同长度的G-四链体二聚体并揭示G-四链体结合剂与二聚体的结合模式。

使用Cu(pyridine)₄作为距离测量的自旋标记，将四方平面Cu(pyridine)₄复合物与G-四链体共价结合，通过检测偶极-偶极相互作用测量𝜋-堆叠的G四元单体中两个顺磁Cu²⁺之间的距离，从而研究二聚体的形成。

[Cu²⁺@A₄]（TTLGGG）与[Cu²⁺@B₄]（TLGGGG）为两种具有不同序列的寡核苷酸，其中，L表示配体。图1和图2为[Cu²⁺@A₄]₂和[Cu²⁺@B₄]₂的DEER实验结果，从DEER结果中可得到[Cu²⁺@A₄]₂二聚体中，单个Cu²⁺ -Cu²⁺的平均距离d_A=2.55 nm，G-四链体3′端通过尾尾叠加形成G-四链体二聚体，且G-四链体二聚体中两个Cu²⁺自旋标签的g_z轴平行排列。

与[Cu²⁺@A₄]₂二聚体相比，[Cu²⁺@B₄]₂  𝜋堆积距离比 [Cu²⁺@A₄]₂二聚体长（d_B-d_A = 0.66 nm），证实了每个[Cu²⁺@B₄]单体含有一个额外的G四分体，这个结果与预期距离完全一致。因此，通过DEER技术进行距离测量，可区分不同长度的G-四链体二聚体。

图1 (A) [Cu²⁺@A₄]₂二聚体的脉冲EPR微分谱(黑线)及其对应的模拟(红线) (34 GHz，19 K); (B)背景校正后在a-d四个场位置的DEER时域图(黑线)及从PeldorFit获得的最佳拟合结果(红线); (C)使用PeldorFit(红线)和MD模拟(灰线)得到的距离分布; (D) [Cu²⁺@A₄]单体和[Cu²⁺@A₄]₂二聚体之间的平衡。(Angew.Chem. Int.Ed. 2021, 60,4939 –4947)

图2 (A)[Cu²⁺@B₄]₂背景校正后在a-d四个场位置的DEER时域图(黑线)及从PeldorFit获得的最佳拟合结果(红线); (B)[Cu²⁺@B₄]的结构示意图; (C)使用PeldorFit(红线)和MD模拟(灰线)得到的距离分布。(Angew.Chem. Int.Ed. 2021, 60,4939 –4947)

许多小分子和金属配合物，具有平面芳香大共轭体系且带正电荷，可以结合并稳定折叠的二级结构，从而成为潜在的抗癌药物。

N,N '' -双[2-(1-哌啶基)乙基]3,4,9,10-苝四羧基二酰盐酸盐（PIPER）就是一种著名的G-四链体结合剂，可通过堆积作用与四链体结合并稳定四链体，通过DEER技术可探究PIPER与G-四链体的结合模式。

图3与图4为不同PIPER与[Cu²⁺@A₄]₂二聚体比例的DEER实验结果。结果显示，当PIPER与[Cu²⁺@A₄]₂二聚体比例为1：1时（PIPER@[Cu²⁺@A₄]₂），d_P = 2.82 nm。

与纯[Cu²⁺@A₄]₂二聚体（d_A = 2.55 nm）相比，Cu²⁺-Cu²⁺之间距离增大，说明了PIPER与二聚体形成了三明治复合物，平面有机分子插在两个G四联单体的3′面之间。当PIPER与[Cu²⁺@A₄]₂二聚体比例为2：1时（2PIPER@[Cu²⁺@A₄]₂），d_2P = 3.21 nm。

与PIPER@[Cu²⁺@A₄]₂二聚体（d_P = 2.82 nm）相比，多了一个𝜋堆积的距离，说明两个PIPER配体插入到尾对尾排列的G四链二聚体中。通过DEER技术可揭示G -四链体结合剂PIPER插入G-四链体二聚体中形成夹层复合物的新结合模式。

图3 (A)含有不同PIPER与[Cu²⁺@A₄]₂二聚体比例的DEER偶极谱(g_eff =2.061); (B)含有不同PIPER与[Cu²⁺@A₄]₂二聚体比例的DEER调制深度;(C)[Cu²⁺@A₄]₂二聚体和PIPER@[Cu²⁺@A₄]₂、2PIPER@[Cu²⁺@A₄]₂、PIPER@[Cu²⁺@A₄]的平衡。

(Angew.Chem. Int.Ed. 2021, 60,4939 –4947)

图4 (A)PIPER@[Cu²⁺@A₄]₂的DEER时域谱;(B)使用PeldorFit(红线)和MD模拟(灰线)得到的PIPER@[Cu²⁺@A₄]₂距离分布; (C)2PIPER@[Cu²⁺@A₄]₂的DEER时域谱; (D)使用PeldorFit(红线)和MD模拟(灰线)得到的2PIPER@[Cu²⁺@A₄]₂距离分布。

(Angew.Chem. Int.Ed. 2021, 60,4939 –4947)

国仪量子脉冲式电子顺磁共振波谱仪EPR100支持电子-电子双共振技术，可用于研究复杂膜蛋白、DNA、RNA、核酸蛋白复合体以及在各种疾病中产生关键作用的相关蛋白质分子的结构定位、功能解释、生理运动过程以及作用机理解释。

国仪量子X波段脉冲式电子顺磁共振波谱仪EPR100

国仪量子EPR100的DEER实验结果

使用DeerAnalysis处理后的实验结果